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共刺激分子4-1BBL分子在急性髓细胞白血病中的表达及其生物学意义
目的:研究分析共刺激分子4-1BBL分子在急性髓细胞白血病中的表达及其生物学意义.方法:选取本院2013年9月～2014年9月期间收治初诊为急性髓细胞白血病(AML)患者17例,采用流式细胞仪检测AML患者白血病细胞表面共刺激分子4-1BBL分子的表达,并采取可介导4-1BBL逆向信号的mAB 1F1单抗共培养,以7例正常人骨髓细胞为对照组.采用3H-TdR掺入法观察AML患者白血病细胞体外增殖情况.结果:AML患者白血病细胞的4-1BBL分子表达率较高,通过3H-TdR掺入法检测核实mAb 1 F1对这类细胞系的作用明显.正常7例骨髓细胞中未见4-1BBL表达.结论:共刺激分子4-1BBL分子在急性髓细胞白血病中的表达较高,该分子能够行逆向信号促白血病细胞增殖.
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制备人工抗原提呈细胞促进NK细胞增殖和抗肿瘤效应的研究
目的 制备双表达CD86和4-1BBL的人工抗原提呈细胞,建立在体外大量的扩增具有较高杀伤活性的人NK细胞的有效方法.方法 将表达CD86和4-1BBL的慢病毒感染K562细胞,制备成人工抗原提呈细胞(aAPC),与人外周血单个核细胞(PBMC)共培养,使NK细胞在体外大量扩增.结果 在培养d15天时,细胞数量达到2.7×1010个,CD3 CD56+细胞纯度达到99.4％,细胞体外杀伤活性为96.27±1.27％;在小鼠肺癌模型中,治疗组比对照组肿瘤体积明显减小.结论 成功制备了有效扩增NK细胞的人工抗原提呈细胞(aAPC),建立了在体外高效扩增具有较高杀伤活性的NK细胞的有效方法,为肿瘤和慢性感染性疾病的过继细胞免疫治疗奠定了基础.
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sPD-1和4-1BBL体内联合表达对小鼠实验性肝癌的治疗作用
目的 探讨sPD-1和4-1BBL联合治疗肿瘤的效应和相关的免疫学机制.方法 以H22肝癌细胞接种于BALB/c小鼠右后腿肌肉内,建立小鼠肿瘤模型;采用4-1BBL和可溶性PD-1(sPD-1)真核表达质粒通过肌肉转染进行基因治疗;检测小鼠肿瘤生长情况,并检测转染基因及肿瘤微环境中免疫调控相关基因的表达,检测肿瘤组织中的淋巴细胞数量的变化.结果 单独转染4-1BBL基因或sPD-1基因均显示出抗肿瘤作用,而联合治疗对肿瘤生长抑制作用更为明显,该组抑瘤率高达92.3%(以pcDNA3.1组为对照),显著高于4-1BBL组(78%)、sPD-1组(70.2%).联合治疗不仅使TGF-β、IL-10的表达下调,而且在治疗后期更有效地促进IFN-γ和IL-2基因表达上调,且使瘤组织中CD8+T淋巴细胞数量较其他各组显著增加.结论 4-1BBL和sPD-1联合治疗可使肿瘤微环境中的免疫相关基因表达更有利于抗肿瘤免疫应答,增强肿瘤免疫治疗效果.
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共刺激分子4-1BBL在过敏性支气管哮喘患者外周血的表达及其意义
目的 4-1BBL(CD137L)为肿瘤坏死因子超家族成员,4-1BBL与其受体4-1BB结合为T细胞活化提供共刺激信号.有研究证实激动性4-1BBL抗体能降低过敏性哮喘小鼠的气道高反应性,减少气道炎症细胞浸润.但4-1BBL在过敏性哮喘患者中的作用尚不清楚.方法 我们比较了过敏性哮喘患者和健康对照组外周血单个核细胞中4-1BBL mRNA的表达水平和血浆中可溶性4-1BBL(soluble 4-1BBL,s4-1BBL)的浓度,并分析了外周血4-1BBL与哮喘病情的关系.结果 结果为哮喘患者血浆s4-1BBL的浓度(223.47±69.28)μg/L,正常对照组s4-1BBL浓度为(303.12±41.48)μg/L,哮喘组较正常组显著下降(P<0.05),而外周血单个核细胞4-1BBL mRNA水平哮喘组与正常对照组之间差异无统计学意义(P>0.05);哮喘患者s4-1BBL的浓度与血浆屋尘螨特异性IgE无相关性(r=0.072,P>
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4-1BBL基因真核表达载体构建及在肝癌细胞中表达的研究
目的研究含鼠源性4-1BBL真核表达载体体系的构建及其在大鼠肝细胞癌(HCC)细胞系CBRH7919中获得稳定、高效表达的方法.方法将4-1BBL全长cDNA亚克隆到真核表达载体PCI-neo中,获得4-1BBL定向插入重组子PCI-neo-4-1BBL,采用酶切法和测序法鉴定.用阳离子脂质体将PCI-neo-4-1BBL转染CBRH7919,经G418筛选,获得阳性克隆,命名为PCI-neo-4-1BBL-CBRH7919+细胞.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测4-1BBL在CBRH7919中的表达.结果 PCI-neo-4-1BBL经限制性内切酶切,电泳后显示有980 bp的4-1BBL目的基因片段和5.4 kb的线性化PCI-neo载体片段;重组子测序结果与Genbank中4-1BBL cDNA序列相符,证实构建成功.RT-PCR检测到4-1BBL在PCI-neo-4-1BBL-CBRH7919+细胞中获得稳定表达.结论重组4-1BBL真核表达载体构建正确,并在PCI-neo-4-1BBL-CBRH7919+细胞中获得稳定、高效表达.
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同时表达4-1BBL B7.1及B7.2三个共刺激分子基因小鼠肝癌细胞系的建立和意义
目的:建立同时表达4-1BBL、B7.1及B7.2三个共刺激分子基因小鼠原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞系.方法:将B7.1和B7.2全长cDNA的质粒酶切,构建pcDNA3.1-B7.1-IRES-B7.2重组子,酶切法鉴定.用阳离子脂质体(Lipofectamine Reagent)将重组子转染H22,经均霉素(Hygromycin,300μg/ml)筛选,阳性克隆命名为H22-CD80/CD86+细胞.逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测目的基因在H22-CD80/CD86+变异株的表达.采用同样方法将pCI-neo-4-1BBL质粒转入H22-CD80/CD86+细胞,G418筛选,阳性克隆命名为H22-CD80/CD86/CD137L+细胞.流式细胞仪检测三种基因在细胞克隆中的表达.结果:pcDNA3.1-B7.1-IRES-B7.2重组子经酶切鉴定,同时获得B7.1(862bp)和B7.2(984bp)目的基因片段和5.6kbp线性化pcDNA3.1载体片段;重组子测序结果与Genebank中B7.1和B7.2序列相符,证实构建成功.RT-PCR及FCM检测结果显示B7.1、B7.2及4-1BBL基因分别在H22-CD80/CD86+细胞及H22-CD80/CD86/CD137L+细胞中获得稳定、高效联合表达.结论:pcDNA3.1-B7.1-IRES-B7.2重组子构建正确,H22-CD80/CD86/CD137L+变异株可同时稳定表达B7.1、B7.2和4-1BBL三个共刺激分子基因.
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人4-1BBL基因重组腺病毒载体的构建及其在HEK293细胞的表达
目的 体外构建含有人4-IBBL基因的重组腺病毒载体,并检测其在HEK293细胞中的表达.方法 设计一对含有Sfil酶切位点的4-1BBL因上下游引物,以质粒pCR4-TOP0-4-1BBL为模板,通过PCR扩增获得4-1BBL基因全序列.片段回收后经酶切处理,连接到穿梭质粒pShuttle-CMV-EGFP上,获得重组穿梭质粒pShuttle-ECFP-4-1BBL.经Sfil酶切、PCR及插入片段测序鉴定正确后,将其用I-Ceul和I-Scel双酶切处理,转移到pAdxsi载体上,得到pAdxsi-GFP-4-1BBL病毒质粒,PCR鉴定正确后,经HEK293细胞包装成复制缺陷型腺病毒Ad-4-1BBL,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Western blot检测目的 基因人4-1BBL的表达.结果 酶切鉴定和序列分析证实,重组腺病毒质粒含有人4-1BBL全长cDNA编码序列,病毒滴度为1.2×10<'10>pfu/mL.转染HEK293细胞后荧光显微镜下观察到CFP的表达,Western blot检测可见4-1BBL蛋白的正确表达.结论 人41BBL基因重组腺病毒载体的成功构建和在HEK293细胞中的表达,为下一步将其应用于前列腺癌的免疫治疗奠定了基础.
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一株鼠抗人4-1BBL功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究
目的:鼠抗人4-1BBL功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定.方法:以高表达人4-1BBL分子的基因转染细胞L929/4-1BBL为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴瘤杂交瘤技术进行细胞融合,经流式细胞术分析和多次克隆化培养,筛选特异性杂交瘤细胞株;采用Ig亚型快速定性试纸法、染色体核型分析、竞争结合抑制试验、间接免疫荧光法对单抗的生物学特性进行鉴定,并采用体外细胞计数和ELISA检测分析单抗对单核细胞的作用.结果:获得1株持续、稳定分泌鼠抗人4-1BBL单抗的杂交瘤细胞株,命名为3E7.该单抗能识别人白血病细胞株和单核细胞表面的4-1BBL分子.对单抗生物学功能的研究结果表明,该单抗能有效地促进外周血单核细胞体外生长,并促进IL-6和TNF-α的分泌.结论:成功地获得了一株鼠抗人4-1BBL功能性单克隆抗体3E7,该单抗能特异地识别人4-1BBL分子,并有效地通过激发4-1BBL逆向信号通路促进单核细胞的体外生长及细胞因子的分泌.
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真核表达4-1BBL调节淋巴细胞功能活性及抗肿瘤效应的研究
目的:在非免疫非肿瘤细胞中转染表达4-1BBL,并研究4-1BBL在调节淋巴细胞功能活性及抗肿瘤方面的作用和机制.方法:构建含有4-1BBL全长cDNA序列的表达质粒p4-1BBL,脂质体介导体外转染BHK细胞,G418筛选出阳性克隆,RT-PCR、免疫细胞化学染色及免疫印迹检测4-1BBL的表达,检测BHK细胞表达的4-1BBL对脾淋巴细胞增殖和杀伤活性的影响;建立小鼠H22肝细胞癌移植瘤模型,裸DNA肌肉注射法体内转染表达4-1BBL进行肿瘤治疗,检测肿瘤生长速度;另外,利用免疫组化染色法分析瘤周组织中CD8+T淋巴细胞.结果:BHK细胞转染表达的4-1BBL能够显著增强肿瘤抗原肽激活的脾淋巴细胞增殖和杀瘤活性(P＜0.01),并显著提高IL-2和IFN-γ表达水平(P＜0.01),同时增强非特异性免疫杀伤活性.肿瘤接种部位转染表达4-1BBL,瘤周组织中CD8+T淋巴细胞数量显著增加(P＜0.01),肿瘤生长速率显著低于生理盐水对照组和空载体对照组(P＜0.01).结论:在肿瘤微环境中的正常细胞转染表达4-1BBL,能够有效促进T细胞增殖及杀伤等功能活性,可望成为肿瘤免疫生物治疗的一种新的手段.
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共刺激分子4-1BBL高表达与肿瘤免疫逃逸关系的研究
目的:观察高表达4-1BBL的HL-60细胞培养上清液对人淋巴细胞活化、增殖、IL-2分泌及凋亡诱导作用的影响;分析阻断4-1BB/4-1BBL信号对肿瘤细胞增殖、细胞因子分泌的影响,揭示肿瘤的免疫逃逸机制.方法:将不同浓度的HL-60肿瘤细胞培养上清液与体外分离的人淋巴细胞共培养,MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测免疫表型、细胞因子分泌及细胞凋亡;ELISA法检测IL-2分泌水平;用抗4-1BBL单抗作用后,观察对HL-60细胞增殖及细胞因子分泌的影响.结果:不同的肿瘤细胞株表面均有4-1BBL表达,但表达水平不同;HL-60细胞培养上清液对淋巴细胞活化没有明显影响(P＞0.05),但能明显抑制淋巴细胞增殖(P＜0.01)和IL-2分泌(P＜0.05),诱导淋巴细胞凋亡(P＜0.05).抗4-1BBL单抗能抑制HL-60细胞增殖和TGF-β的分泌(P＜0.05).结论:HL-60细胞高表达4-1BBL具有反向调节作用,可通过促进肿瘤细胞增殖及TGF-β分泌等抑制淋巴细胞功能,从而使之逃避宿主的免疫监视.
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4-1BBL胞外区cDNA的克隆及鉴定
目的研究共刺激分子4-1BBL对T淋巴细胞的作用,并进一步研究肿瘤的免疫治疗.方法按照4-1BBL的基因序列,设计合成了可扩增4-1BBL胞外区的引物序列,用RT-PCR方法从急性B淋巴白血病Raji细胞系细胞中提取总RNA,扩增出4-1BBL胞外区片段,并克隆到载体中,经酶切鉴定后再进行序列分析.结果所克隆的目的片段经EcoRI和XhoI双酶切和序列分析证明正确.结论已成功地钓取4-1BBL胞外区基因并克隆到pMD-18载体上.
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口服含4-1BBL基因质粒疫苗菌对大鼠免疫功能的影响
利用减毒沙门氏菌为载体将4-1BBL体内转染抗原提呈细胞,观察体内4-1BBL基因转染对大鼠免疫功能的影响.构建含plRES2一EGFP-4-1BBL质粒的减毒沙门氏菌(疫苗菌),通过体外感染HepG2细胞观察疫苗菌的侵袭功能和携带外源基因能力,验证疫苗菌作为4-1BBL基因转染载体的作用.疫苗菌2周内连续灌服大鼠3次,末次灌服后14 d心脏取血处死,RT-PCR和荧光显微镜检测报告绿色荧光蛋白(GFP)在脾脏细胞中的转录表达,流式细胞仪检测外周血和脾脏中细胞表型变化.疫苗菌在体外能成功的将外源基因携带至HepG2细胞进行表达,灌服疫苗菌的大鼠外周血和脾脏细胞4-1BBL和4-1BB表达明显升高.外周血中CD3+、CD3+CD86+和CD3+CD256+,脾脏细胞中CD3+CD8+、CD3+CD25+也有明显的增高.表明含4-1BBL基因的减毒沙门氏疫苗菌能实现体内基因转染,4-1BBL的高表达能增强机体的细胞免疫功能.
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激发型4-1BBL单抗在体内对人白血病系胞系SHI-1生物学行为的影响
通过激发型4-1BBL单抗作用于人M5型白血病-SCID小鼠模型,研究4-1BBL/4-1BB逆向信号在体内对M5型白血病细胞系SHI-1生物学行为的影响.将1×106 SHI-1细胞移植至SCID小鼠腹腔,经1F1单抗作用,于移植30 d后小鼠尾静脉取血并采用流式细胞术(FCM)监测4-1BBL阳性细胞表达率.于移植42 d后处死小鼠,通过病理组织学检查和FCM,分析SCID小鼠的骨髓、外周血、肝脏和脾脏中白血病细胞的浸润及病理变化.结果:各组小鼠腹腔均可发现瘤块生长.单抗作用组小鼠肿块出现较早,生长速度较快,其主要组织器官更发现有肿瘤细胞的浸润.1F1单抗在体内可促进SHI-1细胞的增殖与迁移,这为研究M5型白血病的发生与发展提供了理论依据.
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双表达外源性4-1BBL/IL-15的K562细胞活化外周血淋巴细胞的研究
为肿瘤过继免疫治疗开发体外激活T细胞、NK细胞的高效途径,研究双表达外源性4-1BBL和IL-15的K562细胞刺激外周血淋巴细胞活化的能力.采用分子克隆技术,分别将4-1BBL和IL-15基因插入双表达载体pVITRO-2,命名为pV4-1BBL-IL-15.经测序鉴定后,利用脂质体介导的转染及潮霉素筛选,获得稳定双表达4-1BBL、IL-15分子的K562细胞(K562/4-1BBL/IL-15).经流式细胞仪(FACS)分选后,K562/4-1BBL/IL15细胞和K562细胞分别用丝裂霉素C处理,与外周血淋巴细胞孵育24 h,FACS检测淋巴细胞表面活化性受体CD69的表达.对NK细胞不仅同时检测活化性受体NKG2D的表达,还用乳酸脱氢酶释放法观察NK细胞受不同刺激细胞作用后,细胞毒活性的变化.结果显示受K562/4-1BBL/IL15细胞刺激后,T细胞CD69的表达无明显变化.γδT细胞CD69表达增长5倍.NK细胞CD69表达增长6倍,而NKG2D的表达增加1.5倍;NK细胞受K562/4-1BBL/IL15细胞作用72 h后,细胞毒活性明显提高.提示双表达4-1BBL/IL-15的K562细胞能够高效激活γδT细胞及NK细胞,有望用于肿瘤的过继免疫治疗.
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小鼠髓系树突状细胞4-1BB及4-1BBL表达调节
探讨小鼠髓系树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDC)共刺激分子4-1BB及其配体4-1BBL表达的变化.将促 DC成熟活化因子CD40L-CHO、TNF-α、LPS和IFN-γ,免疫负性调节因子IL-10以及各成熟活化因子与IL-10联合加入BMDC中,观察BMDC上4-1BB及4-1BBL表达的变化.结果显示,加入成熟活化因子的各组BMDC上4-1BB及4-1BBL表达与对照组相比有显著上调(P＜0.05).而IL-10组与对照组相比两者的表达显著下调(P＜0.05),且各成熟活化因子与IL-10联合应用与单用IL-10组相比,BMDC上4-1BB和4-1BBL表达上调,有显著性差异(P＜0.05).提示成熟活化因子不仅能上调BMDC上4-1BB和 4-1BBL的表达并且能有效拮抗mIL-10对BMDC上4-1BB和 4-1BBL表达的下调作用.
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4-1BBL逆向信号促进单核细胞的增殖和分泌细胞因子的作用
采用抗人4-1BBL单克隆抗体1F1包被24孔培养板,加入经免疫磁珠阴性选择获得的高纯度人外周血单核细胞,动态观察细胞的生长状态,并用3H-TdR掺入法分析单核细胞增殖,应用ELISA动态测定培养上清中IL-6、IL-10、M-CSF和FL等细胞因子水平.结果发现1F1非常有效地促进单核细胞的增殖,1F1组单核细胞分泌高水平的M-CSF以及IL-6和FL增加,但1F1组单核细胞分泌IL-10水平低于对照组(P<0.05).由此表明,抗人4-1BBL单克隆抗体1F1通过激发单核细胞4-BBL逆向信号,介导单核细胞分泌M-CSF、IL-6和FL.上述细胞因子联合作用,从而促进了单核细胞的增殖.
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过敏性紫癜性肾炎患儿共刺激分子4-1BB/4-1BBL变化及其临床意义
目的：探讨共刺激分子4-1 BB/4-1 BBL在过敏性紫癜性肾炎（HSPN）患儿外周血单个核细胞（PBMC）中的表达及其临床意义。方法选取初发过敏性紫癜无肾炎（HSP组）、初发过敏性紫癜性肾炎（HSPN组）患儿各20例（其中15例进行了肾脏病理检查），20例正常儿童为对照组，分离培养PBMC。应用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测并比较三组PBMC中4-1BB mRNA和4-1BBL mRNA的变化，分析4-1BB/4-1BBL mRNA变化与肾脏病理的关系。结果HSPN、HSP患儿PBMC中4-1BB mRNA、4-1BBL mRNA的表达均高于对照组，差异有统计学意义（P均＜0.01）。HSPN患儿的病理积分与4-1BB/4-1BBL mRNA表达呈正相关关系（r =0.570、0.515，P均＜0.05）。PBMC中，加入植物血凝素后， HSPN组、HSP组和对照组4-1BB/4-1BBL mRNA的表达均高于空白对照组，差异有统计学意义（P均＜0.01），其中HSP、HSPN组增高幅度较对照组明显，HSPN组增高幅度较HSP组更为显著，差异有统计学意义（P均＜0.01）；加入地塞米松后， HSPN组、HSP组4-1BB/4-1BBL mRNA的表达均较空白对照组减少，差异有统计学意义（P均＜0.01）。结论 HSPN患儿PBMC中共刺激分子4-1BB/4-1BBL mRNA的表达显著增高，植物血凝素能诱导其高表达，而地塞米松能抑制其表达，提示4-1 BB/4-1 BBL可能参与HSPN的发病。
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4-1BBL在人口腔鳞癌PBL-SCID鼠嵌合模型肿瘤免疫中的作用
目的:探索建立人口腔鳞癌PBL-SCID鼠嵌合模型,评价4-1BBL在人口腔鳞癌PBL-SCID嵌合模型肿瘤免疫中的作用.方法:SCID鼠右背部皮下注射5×106 (0.2 mL)Tca8113细胞.成瘤后,尾静脉注射anti-asialo-GML多抗,随机分为4组,第①组为对照组,不给予成瘤小鼠免疫重建,第②组给予成瘤小鼠免疫重建,第③组给予成瘤小鼠免疫重建+含有空载体的腺病毒做肿瘤内注射,第④组给予成瘤小鼠免疫重建+含有4-1BBL基因的腺病毒做肿瘤内注射.第②、③、④组小鼠腹腔注射健康志愿者外周血淋巴细胞3×107(0.5 mL),第①组腹腔注射0.5 mL1640培养基.每周记录各组小鼠的成瘤情况,免疫重建后,第2、7周取鼠血,用ELISA法测定人IgG含量.小鼠处死后,比较各组小鼠体重及肿瘤、脾脏的重量.RT-PCR检测4-1BBL基因在瘤体内的表达,HE染色检测肿瘤及脾脏生长情况.结果:模型成瘤率为100％,成瘤潜伏期12～18 d.免疫重建后第2、7周时人口腔癌PBL-SCID嵌合组小鼠血中人IgG分别达71.8 μg/mL、136.9 μg/mL.免疫重建及转染4-1BBL基因组小鼠,肿瘤生长受到明显抑制(P＜0.01).RT-PCR证明4-1BBL基因在瘤体内充分表达,冰冻切片HE染色见肿瘤生长、脾脏有大量淋巴细胞浸润.结论:SCID小鼠皮下注射口腔鳞癌细胞、腹腔注射人淋巴细胞,可建立人口腔鳞癌PBL-SCID嵌合模型,经腺病毒转染4-1BBL基因后,可显著提高宿主对瘤体的抑制作用.
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Tca8113-4-1BBL细胞联合CD28单抗在口腔鳞癌免疫治疗中的作用
目的:探讨转4-1BBL肿瘤细胞联合抗CD28单抗体外诱导抗肿瘤活性的能力.方法:通过脂质体法将重组载体pEGFP/neo-h4-1BBL转染人舌鳞癌细胞Tca8113,经G418(400μg/mL)筛选及有限稀释后,获得稳定高表达克隆,分别用RT-PCR和Western印迹检测转染细胞中h4-1BBLmRNA和蛋白的表达.将转染与未转染4-1BBL基因的Tea8113细胞用丝裂霉素C(MMC)处理后,制成肿瘤细胞瘤苗.联合抗CD28单克隆抗体与经体外抗CD3mAb诱导的人外周血T淋巴细胞共同培养,测定T细胞增殖、CTL杀伤活性及产生细胞因子(IL-2和IFN-γ)的能力.实验数据以SPSS12.0软件包进行方差分析.结果:h4-1BBL基因真核表达载体在Tca8113细胞中获得稳定表达.转染h4-1BBL基因的Tca8113细胞联合抗CD28单抗能显著刺激T细胞活化、增殖(P(0.01),促进IL-2、IFN-γ分泌(P<0.01),并能有效地诱导CTL的特异性杀伤活性(P<0.01).结论:转4-1BBL肿瘤细胞联合抗CD28抗体能显著增强肿瘤细胞的免疫原性,诱导T细胞产生有效的抗肿瘤免疫应答.
关键词： 4-1BBL 抗CD28单克隆抗体 抗肿瘤免疫 细胞毒性T细胞 -
人共刺激分子4-1BBL表达载体的构建及转染Tca8113细胞的研究
目的:克隆人肿瘤坏死因子配体超家族(tumor necrosis factor superfamily,TNFSF)成员4-1BBL基因,构建其真核表达载体,并检测4-1BBL基凶在Tea8113中的表达.方法:从淋巴细胞中提取RNA.用RT-PCR方法将4-1BBL的编码序列cDNA扩增.然后将该基因的编码序列插入真核荧光蛋白载体pEGFP-Cl质粒中.构建成终的表达载体pEGFP-Cl-4-1BBL.运用脂质体方法将pEGFP-Cl-4-1BBL转染Tea8113细胞.转染24h后,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和免疫印迹检测4-1BBL在该细胞中的表达.经G418筛选后.用有限稀释法建立稳定高表达的带有4-1BBL基因的Tca8113细胞系.结果:从淋巴细胞中提取的RNA经RT-PCR扩增出目的基因4-1BBL,其全长大小为768bp.测序鉴定该序列与GenBank中的序列丰廿同.转染pEGFP-Cl-4-1BBL载体的靶细胞Tca8113中,荧光显微镜下可见其表达绿色荧光蛋白,RT-PCR方法检测到目的基因4-1BBL的768bp大小的cDNA扩增产物.裂解的4-1BBL/Tea8113基因转染细胞膜蛋白中相对分子质量约27.5Kd的特异性条带.结论:转染4-1BBL基因细胞株的建立,为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础.
