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根癌农杆菌对云南红豆杉原生质体的转化
本文介绍了根癌农杆菌T-DNA对云南红豆杉原生质体的转化,分析了转化系的紫杉醇合成能力.实验以生长20 d的云南红豆杉幼茎诱导的淡黄色愈伤组织为材料,经酶解可分离出大量有活力的原生质体.在由B5无机盐、KM有机成分、3.0 mg/L 2,4-D、0.1 mg/L KT和0.45 mol/L果糖组成的培养基中培养1周后,原生质体再生细胞持续分裂形成细胞团.根癌农杆菌对原生质体的转化能力与原生质体生长状态及菌株相关.虽然刚分离的或已再生细胞壁的原生质体不能被根癌农杆菌转化,但由10个以上细胞组成的原生质体克隆和根癌农杆菌B6S3菌株共培养后可实现T-DNA转化,高压纸电泳检测转化系具有冠瘿碱的合成,转化率约为5%.HPLC证实转化系具有合成紫杉醇的能力,但不同转化系中紫杉醇含量变异很大,高含量为0.076%,是对照愈伤组织的6倍,表明T-DNA的插入改变了培养细胞对紫杉醇的合成.获得的高产转化系细胞生长比对照低,但继代培养中其生长和紫杉醇积累基本保持稳定.尽管转化系合成紫杉醇能力远未达到商业化生产的要求,但研究通过T-DNA对原生质体的转化而实现插入诱变,可以为分离高产紫杉醇优良细胞系提供单细胞筛选系统.
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细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95-EgA31在根癌农杆菌LBA4404中的表达效率研究
目的 分析细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95-EgA31在根癌农杆菌LBA4404株中的表达效率. 方法 用IPTG诱导根癌农杆菌0、1、3、5、7、9、11和13 h,用SDS-PAGE和Western blot鉴定所表达的蛋白质. 结果 表达产物分子质量单位约为37.5 ku,且能被感染细粒棘球蚴的鼠血清特异识别,表达蛋白约占LBA4404菌体总蛋白的20%. 结论 细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95-EgA31能在LBA4404中表达,为进一步构建细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础.
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根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的影响因子研究进展
遗传转化体系是丝状真菌分子生物学研究的重要工具之一.根癌农杆菌介导法因其操作简便、转化率高、单拷贝插入以及费用便宜等独特的优点成为了丝状真菌遗传转化的首选方法.然而,至今仍有许多种类的丝状真菌未能实现转化,或者转化率太低以至于无法满足实验需要.本文就根癌农杆菌、受体丝状真菌、诱导剂以及培养条件等因素对根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的影响进行论述,以期推动更多种类的丝状真菌获得高效转化.
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抗草甘膦半夏的获得及其草甘膦筛选体系的建立
目的 将抗草甘膦突变基因(aroA-M12)转入半夏,获得草甘膦抗性植株.方法 用携带植物表达载体pASM12的根癌农杆菌LBA4404对半夏进行叶盘法转化;在选择培养基中加入10 mg/L草甘膦进行筛选,获得草甘膦抗性的再生植株;对再生植株进行PCR检测和草甘膦抗性实验.结果 PCR检测表明幼叶的转化频率达23%,叶柄的转化频率达33%,对PCR阳性植株进行草甘膦抗性实验,多数植株在不同程度上表现出对草甘膦的抗性.结论 本实验建立了半夏的遗传转化方法及草甘膦筛选的转化体系.为培育抗除草剂的半夏新品种及草甘膦筛选体系在半夏基因工程中的应用奠定了基础.
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四倍体菘蓝转抗虫基因研究Ⅰ.根癌农杆菌介导的转基因菘蓝
目的将外源半夏凝集素基因(PTA)转入四倍体菘蓝以获得鳞翅目昆虫抗性.方法构建了以CaMV 35S为启动子,新霉素磷酸转移酶(Npt-Ⅱ)为选择标记,带有半夏凝集素基因PTA的pCAMB I A2200植物双元表达载体,应用根癌农杆菌、EHA 105遗传转化四倍体菘蓝.结果菘蓝外植体植株再生率达到95%以上,转化率有10%.结论建立了以6-BA和NAA为主要激素组合的四倍体菘蓝离体分化再生系统和农杆菌介导的转化系统.
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刺五加组织培养与细胞工程进展
综述了国内外对刺五加组织培养与细胞工程研究的现状.分别从体细胞胚胎发生的影响因素:外植体的发育程度和类型、培养基、植物生长调节剂的种类和浓度以及作用特点、体细胞胚胎的形态发生过程与解剖学和人工种子的包埋与萌发;茎尖外植体的离体培养与快速繁殖;根癌农杆菌和发根农杆菌对愈伤组织和新生体胚的遗化转化;毛状根培养生产刺五加次生代谢产物的研究现状进行了评述,并进一步分析了其中存在的问题,提出了一些建议.
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322根癌--一种具生物活性的植物肿瘤
根癌系由根癌农杆菌诱导的植物肿瘤.作者研究了蓝桉Eucalyptus globulus根癌多种提取物的细胞毒、抗氧化、抗炎、胚胎毒、抗肿瘤启动和抗微生物等作用.
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根癌农杆菌EHA105和LBA4404冻融法转化条件的优化研究
对传统的根癌农杆菌冻融法转化条件进行优化,研究了根癌农杆菌EHA105和LBA4404的菌株生长状态、CaCl2浓度、质粒加入量、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG4000)对质粒pBI121-Ctube转化根癌农杆菌EHA105和LBA4404的影响.结果表明:EHA105比LBA4404更容易接受外源质粒,两株农杆菌在Ca2+浓度为0.06 mol/L时,感受态转化能力佳.OD600分别为0.5和0.4时,EHA105和LBA4404的转化效率较高.10 μg的pBI121-Ctube质粒会降低转化率.低浓度的DMSO和PEG4000均可以提高转化率,浓度过高会抑制农杆菌转化甚至产生毒害作用.在初步优化的感受态细胞中,添加DMSO和PEG4000(4％)的EHA105和LBA4404感受态细胞,转化率比没有DMSO和PEG4000制备的佳农杆菌感受态细胞转化效率增加了28.6和22.3倍(P＜0.01),结果表明该法比传统的优化效果更加有效.
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变形链球菌乳酸脱氢酶与霍乱毒素B亚单位嵌合基因植物表达质粒的构建及转化烟草研究
目的 构建含变链菌乳酸脱氢酶(LDH)和霍乱毒素B亚单位(CTB)嵌合基因的植物表达质粒并以根癌农杆菌介导法转化烟草,获得转基因烟草.方法 应用PCR技术扩增嵌合基因,并与植物中间表达载体p2355双酶切连接,构建植物表达载体p2355-ldh-ctxB,电击法导入根癌农杆菌EHA105,根癌农杆菌叶盘转化法转化烟草,对抗性植株进行PCR、GUS组织染色、RT-PCR检测.结果 载体p2355-ldh-ctxB经双酶切及PCR证实均能得到与预期相符的片段,农杆菌介导转化烟草得到的抗性植株GUS组织染色呈阳性,PCR扩增nptⅡ基因和目的 基因部分片段,均获得了与预计相符的片段,部分样品RT-PCR能扩增出与预期一致的片段.结论 成功构建植物表达质粒p2355-ldh-ctxB,经根癌农杆菌介导转化烟草后获得了转基因烟草植株.
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FMDV vp1基因在豆科牧草百脉根中的转化与表达
通过根癌农杆菌介导法,将FMDV阿克苏(Akesu/O/58)株结构基因vp1转化豆科牧草百脉根子叶和子叶柄,其愈伤、芽和生根等过程经50 mg/L Kan筛选后,获得Kan抗性百脉根植株.对抗性植株进行vp1基因的PCR、RT-PCR检测和VP1蛋白的Western-blotting杂交.结果表明:vp1基因转入百脉根中,检测有转录活性;目的蛋白获得了正确表达;扩繁和移栽后获得了批量转基因百脉根,为下一阶段的动物试验提供了实验材料.
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根癌农杆菌介导的烟曲霉几丁质合成酶chsC基因缺失突变体的构建
目的 利用根癌农杆菌介导的基因转化定点插入突变几丁质合成酶chsC基因,实现基因失活而构建几丁质合成酶chsC基因缺失烟曲霉突变体.方法 构建根癌农杆菌二元载体pDHt/SK,利用根癌农杆菌介导的转化插入突变烟曲霉几丁质合成酶chsC基因,用潮霉素抗性基因筛选转化子,并进行实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定.结果 潮霉素抗性基因通过同源重组成功插入烟曲霉基因组中;经RT-PCR鉴定,烟曲霉几丁质合成酶基因chsC表达失活.结论 利用根癌农杆菌介导的基因转化可以定点插入突变并失活目的基因,此方法有可能成为烟曲霉基因转化和功能基因组研究的有力工具.
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根癌农杆菌介导灰毡毛忍冬遗传转化体系的建立
目的:在建立灰毡毛忍冬再生体系的基础上,建立其遗传转化体系.方法:组织培养方法培养幼苗,根癌农杆菌介导方法转化外植体,gus染色和PCR检测报告基因.结果:侵染时间8 min能获得较理想的转化效果.35 mg/L的卡那霉素和600 mg/L头孢霉素能得到很好的筛选效果,起主导作用的因素是卡那霉素浓度,其不同的浓度间抗性芽诱导率达到了极显著差异.对转基因植株进行gus染色和PCR检测,结果表明gus基因已整合到灰毡毛忍冬基因组中.结论:首次建立了根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,EHA105菌株)介导的叶片为受体的遗传转化体系.
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重组人β-防御素-2基因的植物表达载体的建立
目的:许多证据表明:利用转基因植物作为生物反应器规模化生产高附加值的药用重组蛋白质,其技术可行、成本低廉、效益显著,具有广阔的应用开发前景.本研究拟运用植物转基因技术,尝试构建高效表达hBD-2的植物生物反应器的可能性.方法:将C端带Myc和6xHis双标记的hBD-2的重组DNA克隆到植物真核表达载体pCAMBLA1303中,构建C端带Myc和6xHis双标签的hBD-2的重组植物真核表达载体;并将此载体转化根癌农杆菌LBA4404,利用卡那霉素进行抗性基因筛选,确定根癌农杆菌的阳性克隆;通过根癌农杆菌将外源基因转入马铃薯植物愈伤组织细胞,利用潮霉素抗性基因筛选及PCR检测,监测hBD-2在其中的遗传表达.结果:(1)酶切分析、PCR验证和DNA测序等证据表明,C端6个组氨酸的hBD-2已被正确地插入pCAMBIA1304载体中CaMV 35S和Nos终止子之间,成功构建了重组hBD-2/His基因的植物表达载体rpCAMBIA1304/hBD-2/His.(2)rpCAMBIA1304/hBD-2/His已成功地转化根癌农杆菌LBA4404,阳性克隆菌株已获得.(3)潮霉素抗性进行筛选及PCR检测结果提示:hBD-2 cDNA基因已整合到马铃薯植物愈伤组织的基因组中.结论:结果表明,重组hBD-2/His基因的植物表达载体通过根癌农杆菌介导进入了马铃薯细胞植物愈伤组织.利用植物转基因技术,构建高效表达hBD-2的植物生物反应器具有可能性.
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鱼腥草离体再生及农杆菌介导的遗传转化
[目的]建立鱼腥草离体再生系统和农杆菌介导的遗传转化方法.[方法]以鱼腥草叶片为外植体置于不同激素配比的MS培养基上,进行愈伤组织诱导和分化再生.以根癌农杆菌EHA105/pCAMBIA1305.2进行转化,将外源GUS(β-葡萄糖醛糖苷酶)基因、潮霉素抗性基因转入鱼腥草,以组织化学染色法检测GUS活性,以聚合酶链反应(PCR)法鉴定基因组中的GUS基因.[结果]MS培养基中添加0.1 mg/L α-奈乙酸(NAA)、2.0 mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)、0.5 mg/L呋喃氨基嘌呤(KT)适于以鱼腥草叶片为外植体进行离体再生,出芽率达96.7%.潮霉素作为筛选试剂,使用浓度为2.5 mg/L;头孢霉素作为抑菌剂,使用浓度为250 mg/L.经感染的外植体中GUS反应呈阳性的占75.0%,8周统计抗性芽比率5.5%,PCR分析表明GUS基因已整合到鱼腥草基因组中.[结论]通过鱼腥草离体培养条件的研究及根癌农杆菌介导的遗传转化,获得了较高的离体再生率,实现了鱼腥草的遗传转化.
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细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95构建及其在根癌农杆菌LBA4404中表达效率的研究
目的:构建细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95,分析其在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,At)LBA4404株中的表达效率.方法:从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA,采用RT-PCR方法扩增Eg95编码基因,将该基因定向克隆到植物表达载体pBI121中构建pBI-Eg95重组质粒;电穿孔转化At(LBA4404),抽提质粒进行酶切及PCR鉴定.用IPTG分别诱导rAt 0、1、3、5、7、9、11和13h.用SDS-PAGE和Western blot鉴定所表达的蛋白质.结果:471bp Eg95基因克隆成功.经酶切及PCR证实重组质粒pBI-Eg95成功转入At(LBA4404).用Bio-Rad Quantity one分析系统分析,表达产物分子质量(Mr)约为16.5 kD,且能被感染细粒棘球蚴的鼠血清特异识别,表达效率为约占LBA4404菌体总蛋白的20%.结论:成功构建了细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95,且能在At(LBA4404)中表达,为进一步研究细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础.
关键词： 细粒棘球绦虫 重组质粒pBI-Eg95 根癌农杆菌 构建 表达效率 -
根癌农杆菌介导的烟曲霉转化条件的优化
目的 探讨根癌农杆菌介导烟曲霉的遗传转化及其影响因素.方法 构建根癌农杆菌二元载体PDHt/SK,二元栽体转化根癌农杆菌,分别对共培养温度(23、24、25、26、27、28)℃、媒介(尼龙膜、硝化纤维膜、液相静置培养)、共培养时间(12、24、36、48 h)、预培养加乙酰丁香酮与否、加入乙酰丁香嗣的浓度(100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml);分生孢子与根癌农杆茵的不同比例(1:1、1 : 10、1:100、1:1000)进行根癌农杆菌介导烟曲霉的转化,观察上述条件下的根癌农杆菌介导的烟曲霉转化效率,用潮霉素抗性基因筛选转化子.结果 共培养温度、转化媒介、共培养时间、共培养加入乙酰丁香酮不同的浓度、分生孢子与根癌农杆茵的不同比例均对根癌农杆菌介导烟曲霉转化效率产生影响,但是预培养加乙酰丁香酮与否对根癌农杆菌转化烟曲霉的效率影响不明显.结论 根癌农杆菌可成功介导烟曲霉的遗传转化,其转化过程受诸多因素的影响.
