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2株重组弓形虫P30抗原单克隆抗体的制备和鉴定
目的 制备重组P30抗原单克隆抗体,研究其生物活性.方法 重组质粒pET28b-P30经BL21 (DE3)表达,纯化、复性后免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备单克隆抗体.ELISA筛选阳性克隆,经亚克隆建株.体内诱生腹水法制备抗体,测定其亚类、效价,Western blot分析其特异性,双单抗夹心-ELISA测定其敏感度.双单抗夹心-ELISA法检测弓形虫感染鼠血清中的CAg.结果 筛选出2株抗重组P30的单克隆抗体9D7、2H9, 抗体重链分别为IgG2a、 IgG1, 轻链均为κ链, Western blot显示2株单抗均能识别弓形虫速殖体天然P30抗原.双单抗夹心-ELISA检测抗原量为0.5 μg/ml;同法检测鼠血清中的CAg,感染第4、6、8 d的阳性率分别为20%、60%、60%.结论 制备的P30抗原单克隆抗体具有较高的敏感性和特异性,为其应用研究打下了基础.
关键词: 重组P30抗原 杂交瘤技术 单克隆抗体 双单抗夹心-ELISA 循环抗原 -
基因工程抗体亲和力成熟研究进展
自 1975 年,Kohler 创建杂交瘤技术并成功制备单克隆抗体以来,人们已研制出数以千计的单克隆抗体.单克隆抗体因其高度的靶向特异性已经成为科学研究,疾病诊断,药物靶向治疗等不可或缺的工具.由于杂交瘤技术制备单克隆抗体为鼠源性,在人体应用时易发生免疫排斥反应,难以有效激发人体免疫效应,而人源的基因工程抗体很好地解决了这一问题.借助 DNA 重组和蛋白质工程技术,人们可以获得人源单克隆抗体,并可在基因水平对抗体进行拼接、修饰、重新组装成为一种新型抗体.
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HAb18Gedomab1单抗的制备及功能研究
目的:制备抗人HAb18G/CD147胞外区蛋白(HAb18Ged)的单抗HAb18Gedomab1,并对其理化性质和生物学功能进行分析鉴定.方法:用HAb18Ged免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术,融合并筛选分泌抗人HAb18Ged蛋白单抗的杂交瘤细胞株,制备腹水,采用离子交换层析法纯化该抗体.采用流式细胞术、免疫组化等方法对其特异性进行鉴定,并通过明胶酶谱、Ⅰ型胶原酶谱、重组基底膜降解实验研究该抗体的体外生物学功能.结果:获得一株稳定分泌抗人HAb18G/CD147胞外区蛋白单抗的杂交瘤细胞株HAb18Gedomab1,滴度为:1:106,纯化后HAb18Gedomab1单抗的纯度大于90%,抗体亚型属IgG1型.流式细胞术及免疫组化结果证明,该抗体与FHCC-98细胞膜抗原及肝癌组织均呈特异性结合.生物学功能研究表明,HAb1 8Gedomab1可刺激鼠成纤维细胞(3T3)分泌明胶酶MMP-2,MMP-9及胶原酶MMP-1,MMP-8,并具有促进基底膜降解的作用.结论:HAb18Gedomab1单抗可特异识别HAb18Ged,刺激MMPs分泌,促进基底膜降解.
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慢性乙型肝炎治疗的过去、现在和未来
Blumberg博士在1963年通过蛋白电泳技术,在来源于澳大利亚的一份血样中发现了一种新型的抗原,并命名为澳大利亚抗原(Australia antigen, AuAg),后来证实这种AuAg与乙型肝炎(hepatitis B,HB)相关,事实上属于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的表面抗原,从而开启了乙型肝炎研究的新时代[1]。也正是因为这一重要发现,Blumberg博士获得了诺贝尔医学奖。在此后的50多年里,乙型肝炎研究领域出现了许多重要发现和进展,包括一系列的诊断技术的应用。上个世纪80年代出现的杂交瘤技术和分子克隆技术,促进了乙型肝炎病原学研究的不断进步。酵母细胞表达的重组乙肝疫苗在HBV感染高流行区的预防控制方面发挥了重要作用。同时,临床医师对乙型肝炎患者自然史的研究,也成为医学界临床疾病研究的一个典范[2]。
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抗腐败西瓦菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及初步鉴定
目的 制备和鉴定抗腐败西瓦菌单克隆抗体(mAbs),为建立重要海洋细菌快速ELISA检测试剂盒奠定基础.方法 用灭活腐败西瓦菌免疫小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术,制备出抗腐败西瓦菌杂交瘤细胞株,用Giemsa染色对其进行染色体鉴定,并用间接ELISA方法筛选、鉴定其与腐败西瓦菌及其他重要海洋细菌的交叉反应性和效价.结果 共获得4株抗腐败西瓦菌的杂交瘤细胞株(02D6、02H12、03G4、03A7),均符合杂交瘤细胞染色体特点,其培养上清效价为10-1~10-2,具有良好的特异性和免疫反应性.结论 研究制备、筛选出抗腐败西瓦菌的特异性抗体,有助于进一步建立重要海洋细菌快速检测试剂盒.
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湖南省2000年医药卫生科研进展
一、基础医学研究1.鼻咽癌抗独特型抗体的制备及主动免疫机制研究:中南大学湘雅医学院研究人员根据Jerne免疫网络理论,首先用小鼠杂交瘤单克隆抗体技术,以鼻咽癌细胞株为免疫原,制备了一系列抗鼻咽癌的单抗(Ab1).再用与钥孔()血兰素的交联物抗体为免疫原和小鼠杂交瘤技术制备了作用与Ab1的V区的抗独特型抗体(Ab2),并证实其中某些Ab2具有鼻咽癌相关抗原的内影像(Ab2β),以此抗体(Ab2)免疫小鼠,诱导与鼻咽癌细胞发生特异性结合的抗血清即抗独特型抗体(Ab3)和和特异性迟发型超敏反应(DTH),提示其具有抗肿瘤作用.Ab3与相应Ab1竞争结合鼻咽癌细胞上的靶抗原,说明Ab3与Ab1具有相同配位.这些结果证明Ab2型抗原能替代肿瘤抗原,并在小鼠体内诱导特异性细胞免疫和体液免疫.将所获得Ab2用氢氧化铝凝胶沉淀法制剂后对晚期鼻咽癌病人进行免疫,能明显提高特异性抗肿瘤抗体的含量.病人接受免疫后,肿瘤坏死因子、干扰素和白介素-2的血清含量升高.这些结果说明用抗独特型抗体进行主动免疫可能增强肿瘤患者的抗肿瘤免疫功能.
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抗人活化血小板单克隆抗体SZ-51的研制及其在血栓研究中的作用
血小板的活化是血栓形成过程中一个重要的病理过程.本研究室利用杂交瘤技术制备了国内第一株抗人活化血小板单克隆抗体SZ-51,并利用这株单抗对血小板的活化及其在血栓形成和血栓性疾病的发病机理、诊断和治疗中的应用价值等方面进行了研究.现将我室七年来在SZ-51方面研究的科研成果归纳如下:
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抗胆汁螺杆菌单克隆抗体的制备
目的 制备抗胆汁螺杆菌单克隆抗体(McAbs).方法 用胆汁螺杆菌B2m株皮下免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术进行融合.以酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选抗胆汁螺杆菌单克隆杂交瘤细胞株并初步鉴定其特异性;免疫印迹试验测定单抗所结合的抗原表位;免疫双向扩散试验确定IgG亚类;腹腔接种法、辛酸-硫酸铵盐析法大量制备、纯化单克隆抗体.结果 经过ELISA筛选获得11个阳性杂交瘤细胞株,其效价高达1.4×105以上,并与实验动物常见的15种病原菌呈阴性反应;IgG亚类为IgC2a和IgG2b;免疫印迹试验显示,6株(A~F)与胆汁螺杆菌大约相对分子质量(17、20、21、30、52、66)×103的抗原特异结合,5株(G~K)皆与胆汁螺杆菌、幽门螺杆菌等三种螺杆菌大约相对分子质量(52、82)×103的抗原呈阳性反应,表明A~F株针对的是胆汁螺杆菌特异性抗原,G~K株可能具有属特异性.结论 筛选的单克隆抗体具有较高的特异性和敏感性,所结合的抗原为胆汁螺杆菌或螺杆菌的免疫优势抗原,为进一步的种、属生物学特性研究、菌株分型及血清学检测方法建立等奠定了基础.
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肿瘤抗体治疗与基因抗体治疗的前景
早在1888年,von Behring新发现在白喉或破伤风毒素免疫动物后,其血清中可产生一种中和毒素的物质,从而开始进行抗体研究,他因此获得了第一届诺贝尔奖.但由于这种免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物,特异性不高,容易出现交叉反应,所以其应用受到限制,在随后很长一段时间,抗体技术并没有重大突破.直到1975年,Kohler和Milstein成功研究出杂交瘤技术(获诺贝尔奖),出现单克隆抗体(MAb),这才有了真正意义上的治疗性抗体,为肿瘤的治疗提供了一种新的方法--肿瘤的抗体导向治疗法.
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B细胞非霍奇金淋巴瘤的放射免疫治疗进展
随着单克隆抗体(单抗)及杂交瘤技术的发展,肿瘤免疫导向治疗逐渐受到人们的重视.过去的十余年中,单抗免疫治疗的研究取得了可喜的进步,尤其是基因工程制备的人鼠嵌合抗CD20抗体(Rituximab,美罗华)经Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床研究证明疗效显著.与传统的化学药物治疗和放射治疗相比,单抗与肿瘤细胞结合更具选择性,可以相对地保护正常组织,从而针对肿瘤细胞进行靶向治疗,减少其不良反应.尽管如此,仍有半数的惰性非霍奇金淋巴瘤(NHL)和2/3的复发侵袭性NHL患者应用美罗华无效,为了增强抗体的治疗作用,研究人员尝试将具有细胞毒作用的放射性核素标记到抗体上,利用抗体的导向作用,引导放射性核素达到靶位点杀伤肿瘤细胞,即放射免疫治疗(radioimmunotherapy,RIT).现就RIT在B细胞NHL中的研究进展作一综述.
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溶脲脲原体单克隆抗体的制备和免疫学特性分析
目的建立快速、灵敏及特异的检测溶脲脲原体免疫诊断方法.方法应用淋巴细胞杂交瘤技术,制备单克隆抗体,并对其进行鉴定.结果共获得7株能持续、稳定分泌抗支原体抗体的杂交瘤细胞系.单抗的类别4株为IgG1,3株为IgG2b.用ELISA法鉴定特异性良好.结论制备的抗溶脲脲原体单克隆抗体特异性强、效价高.
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抗钙调素单克隆抗体的制备及鉴定
目的制备及鉴定抗钙调素单克隆抗体.方法以碳化二亚胺法将钙调素-卵清蛋白偶联物作为免疫原,采用常规免疫方法免疫BALB/C小鼠,杂交瘤技术制备抗牛脑钙调素单克隆抗体.酶联免疫吸附法(ELISA)检测,应用硫酸铵盐析法和离子交换层析法进行抗体纯化.分别采用免疫印迹、免疫酶斑点法鉴定抗钙调素单克隆抗体的性质.结果脾细胞与骨髓瘤细胞的融合率为85%.阳性克隆率为0.35%,获得两株动物钙调素单克隆抗体,抗体效价为1:1000,对钙调素有较强的专一性.结论此研究制备出了高特异性、高亲和力及高效价的抗牛脑钙调素单克隆抗体.
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抗钙调素单克隆抗体的制备及开发利用
目的抗钙调素单克隆抗体的制备及开发利用.方法以碳化二亚胺法将钙调素-卵清蛋白偶联物作为免疫原,采用常规免疫方法免疫BALB/C小鼠,杂交瘤技术制备抗牛脑钙调素单克隆抗体.酶联免疫吸附法(ELISA)检验,应用硫酸铵盐析法进行了抗体的纯化.结果采用免疫印迹、免疫酶斑点法及液相竞争法鉴定了抗钙调素单克隆抗体的性质,表明该抗体对钙调素有较强的特异性.结论此研究制备出的高特异性、高亲和力及高效价的抗牛脑钙调素单克隆抗体可用于胞外钙调素促进皮肤创伤修复的基础研究,也可用于免疫学定量分析、免疫学定位分析及共沉淀分析,具有较好的经济价值.
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抗dsDNA抗体细胞穿透在系统性红斑狼疮中的致病作用
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)可造成多系统、多器官的损害,其中常受累的器官是肾脏[1].抗dsDNA抗体是SLE的标志性抗体,特别是高亲和力的IgG型抗dsDNA抗体在狼疮肾炎的发病机制中发挥了很大作用.临床上,可以在狼疮肾炎活动期的病人肾脏中洗脱出抗dsDNA抗体,提示这种抗体可能导致器官的损害.SLE患者肾脏疾病的严重性常与抗dsDNA抗体的滴度呈正相关,通过皮质醇类药物治疗,可以降低患者抗dsDNA抗体的滴度,促进炎症的消退.一种新型药物LJP394可以下调B细胞产生抗dsDNA抗体,降低狼疮病人体内抗dsDNA抗体滴度和减少肾脏炎症发生,从而有很好的临床疗效[2].许多实验研究直接或间接证明抗dsDNA抗体在狼疮肾炎发病机制中的作用,Ehrenstein等[3]从狼疮病人体内提取IgG型抗dsDNA抗体,由杂交瘤技术制备大量单克隆抗体,给予严重联合免疫缺陷病(severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠腹腔内注射这些抗体,发现这些SCID小鼠出现狼疮肾炎的症状,并且观察到单克隆IgG型抗dsDNA抗体的一些亚型可以和肾小球结合,另一些亚型还可以穿透细胞膜与细胞核结合.这些提示抗dsDNA抗体的一些亚型具有细胞穿透(cell penetration)作用.
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CA19-9和CA50
20世纪80年代通过杂交瘤技术的开发,使单克隆抗体的制备成为可能.由此证实了单克隆抗体所识别的肿瘤相关抗原的决定基多是糖链.其中包括对胰腺癌、胆道癌有用的多数肿瘤标志物.近随着糖链的转移酶基因的解析,其表达机制也正逐渐搞清.本文重点阐述胰腺、胆道癌的代表性肿瘤标志物,即一型糖链抗原的CA19-9和CA50的诊断意义.
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治疗用抗体研究中的几个关键问题
抗体用于疾病的治疗已经有百余年历史了,从初的多克隆抗血清到杂交瘤技术制备的单克隆抗体,都曾对生物医学的进步做出了突出的贡献,并因此而获得诺贝尔生理学和医学奖.目前治疗用抗体的研究已经发展到基因工程抗体阶段,一些关键性问题的逐步解决将使该领域的前景越来越广阔.
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人sCD154胞外段的克隆表达及单抗的研制
目的 构建CD40L胞外段的克隆表达载体,制备针对此蛋白的单克隆抗体,为探讨其生物学特性及功能应用打下基础.方法 采用RT-PcR技术从激活的人PBMC总RNA中扩增出CD40L胞外区cDNA,克隆至载体pcDNA3.1,测序验证后转至表达载体PQE-31中,进一步在大肠杆菌M15中进行表达,亲和层析技术纯化6个His融合的sCD40L蛋白并经western Blot鉴定为目的蛋白.结果 应用人鼠杂交瘤技术,获得此蛋白的单克隆抗体.结论 成功克隆表达sCD40L胞外段及制备其单克隆抗体,制备的单抗具有较好的生物学活性.
关键词: CD40/CD40L RT-PCR 杂交瘤技术 -
CK20单克隆抗体研制及鉴定
目的:研制CK20单克隆抗体.方法:采用CK20抗原免疫小鼠,用免疫的脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞通过PEG4000融合,以HT培养基选择培养,间接ELISA法筛选阳性孔和有限稀释法克隆细胞后,接种小鼠腹腔制备腹水抗体,抗体纯化采用以SPA-Sepharose CL-4B为固定相的亲和层析法,后用双向琼脂扩散法、Western blot和间接ELISA法鉴定抗体的特异性、Ig亚型和效价.结果:获得一株稳定分泌抗CK20单克隆抗体的杂交瘤细胞,染色体众数为101(99~103),其腹水抗体和纯化的抗体效价均为1:106,属IgG1亚型.结论:成功获得了CK20单克隆抗体,命名为L20031030,其特异性强,效价高.
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鼠抗rhGM-CSF单克隆抗体的研制
人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是人体免疫系统产生白细胞过程中的重要蛋白质,能刺激多种造血细胞的增殖、分化及活化作用[1].临床上用rhGM-CSF治疗放疗、化疗引起的粒细胞减少症,已取得了一定的疗效[2].本文运用杂交瘤技术成功地建立了4株能稳定分泌抗rhGM-CSF单克隆抗体的细胞株,对各株单抗的免疫化学特性进行了研究,同时对融合方法进行了一定的探讨.这些研究为单抗的进一步应用提供了依据.
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组织型纤溶酶原激活物单克隆抗体研制及其特性鉴定
目的:应用t-PA单克隆抗体建立ELISA法检测t-PA含量以及研究t-PA功能和结构的关系.方法:运用杂交瘤技术研制5株t-PA单克隆抗体,进行较系统的免疫特性的鉴定.结果:5株单抗特异性高,与u-PA、PLG、Fg、Fb、BSA均无交叉反应;亲和力强,1H4>3C10>5H10>4E6>4C6;腹水效价5×10-6~1×10-7;免疫球蛋白亚类为IgG1和IgG2a;5株抗体中,3C10和1H4可明显抑制t-PA活性,而5H10、4E6、4C6则对t-PA活性无明显影响.结论:为进一步应用这些单抗作为研究手段提供了基础.
关键词: 组织型纤溶酶原激活物 杂交瘤技术 单克隆抗体