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弓形虫酵母表达质粒pPIC9K-GRA1的构建及鉴定
目的 构建弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)的酵母表达质粒,为进一步研究GRA1蛋白功能奠定基础.方法 PCR扩增编码GRA1目的基因,用EcoRⅠ/NotⅠ分别对扩增产物和酵母表达质粒pPIC9K进行双酶切,将GRA1定向克隆到pPIC9K 的EcoRⅠ/NotⅠ位点,对重组质粒进行PCR,双酶切初步鉴定后做序列测定.结果 特异扩增出预期的GRA1片段,大小为573 bp,扩增产物经双酶切后成功连接到pPIC9K中,经PCR,双酶切及序列测定证明重组质粒中含有GRA1读框.结论成功构建弓形虫GRA1酵母真核表达质粒.
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乙型肝炎病毒包膜大蛋白的自激活
目的:构建乙型肝炎病毒包膜大蛋白的酵母表达载体,研究其自激活作用.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBV包膜大蛋白(LHBs),前-S1蛋白(pre-S1),前-S2蛋白(pre-S2)及主蛋白(SHBs)的编码基因,并在其5'端引入EcoRI/BamHI内切酶位点,分别连接入酵母表达载体pGBKT7中,构建酵母表达质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后分别铺于含有X-α-半乳糖的营养缺陷型培养基SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade上进行自激活验证(蓝/白筛选).结果:成功克隆出编码各种HBV包膜蛋白的基因,构建表达载体并在酵母细胞中表达,转化了pGBKT7-LHBs和pGBKT7-preS1的AH109酵母细胞在两种营养缺陷型培养基上均可正常生长,并且可以产生α-半乳糖苷酶从而在铺有X-α-半乳糖的培养基上呈现蓝色,而转化了pGBKT7-preS2和pGBKT7-SHBs的细胞只能在SD/-Trp的培养基上生长,且没有变蓝.结论:LHBs可以作为反式激活子发挥作用,代替GAL4蛋白的激活域来激活GAL4上游激活序列(GAL UAS)和TATA盒,从而激活了下游报告基因(ADE2,HIS3,MEL1和LacZ)的表达,并且其自激活作用来自于前-S1结构域.
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丙型肝炎病毒NS2基因酵母双杂交"饵"载体构建及表达
目的:丙型肝炎病毒NS2蛋白在病毒蛋白加工中起到自裂蛋白酶的作用,但是对人体的作用还不清楚.为探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS2的功能,在真核生物酵母细胞中表达HCVNS2基因.方法:用聚合酶链反应(PCR)的方法以HCV全长质粒pBRTM/HCV-1为模板扩增HCV NS2基因,克隆到pGEM-T载体中,双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达.提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Westem免疫印迹分析.结果:成功构建HCV NS2基因酵母表达载体称为pGBKT7-NS2,Western免疫印迹显示了HCV NS2在酵母细胞中表达.表达产物在胞内存在,相对分子质量23kD左右,表达量占细胞总蛋白的4%左右.结论:我们成功在酵母细胞中表达了HCV NS2蛋白.为以后研究NS2蛋白对人体的作用打下了基础.