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弓形虫GRA1基因在毕赤酵母菌中的表达、纯化与鉴定
目的 研究弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)在毕赤酵母菌中的表达,获得高效表达的具有生物学活性的目的蛋白. 方法 将已构建重组的pPIC9K-GRA1质粒转化入酵母菌GS115,筛选His+Muts 表型转化子,摇瓶培养,1%甲醇诱导表达.表达产物经高效液相色谱法纯化后,测定其生物学活性. 结果 诱导4 d的蛋白表达量达到2.5 g/L.SDS-PAGE 显示表达蛋白的分子质量单位为24 ku,Western blot鉴定表达产物具有抗原性.表达蛋白经高效液相色谱纯化产物后纯度达到90%以上. 结论 弓形虫GRA1基因在毕赤酵母中成功分泌表达目的蛋白,表达产物具有抗原性.
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弓形虫酵母表达质粒pPIC9K-GRA1的构建及鉴定
目的 构建弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)的酵母表达质粒,为进一步研究GRA1蛋白功能奠定基础.方法 PCR扩增编码GRA1目的基因,用EcoRⅠ/NotⅠ分别对扩增产物和酵母表达质粒pPIC9K进行双酶切,将GRA1定向克隆到pPIC9K 的EcoRⅠ/NotⅠ位点,对重组质粒进行PCR,双酶切初步鉴定后做序列测定.结果 特异扩增出预期的GRA1片段,大小为573 bp,扩增产物经双酶切后成功连接到pPIC9K中,经PCR,双酶切及序列测定证明重组质粒中含有GRA1读框.结论成功构建弓形虫GRA1酵母真核表达质粒.
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毕赤酵母菌表达弓形虫GRA1蛋白接种小鼠免疫效果
目的 观察毕赤酵母菌表达弓形虫GRAl蛋白免疫效果.方法 采用皮下注射法免疫接种小鼠,末次免疫后第2周用ELISA检测其特异性抗体水平;流式检测鼠脾淋巴细胞亚群,末次免疫后第3周.用弓形虫RH株速殖子分别攻击感染疫苗免疫组和对照组,观察小鼠感染情况及存活时间.结果 ELISA结果表明,纯化GS115/pvIC9K-GRM表达的蛋白和GS115/pPIC9K-GRA1表达的混合蛋白组抗体水平高于佐剂组、NS对照组及GS115/pPIC9K表达的混合蛋白组(P<0.05);流式结果显示,各组CD4+淋巴细胞细胞数量变化无显著性差异(P>0.05),而CD8+淋巴细胞数量则明显增多,纯化GS115/pPIC9K-GRA1表达的蛋白、GS115/pPIC9K-GRA1表达的混合蛋白组、GS115/pPIC9K表达的混合蛋白组及佐剂组明显高于NS组(P<0.05);小鼠攻击实验表明,与NS及GS115/pPIC9K表达的混合蛋白组相比,纯化GS115/pPIC9K-GRA1表达的蛋白和GS115/pPIC9K-GRA1表达的混合蛋白组小鼠存活时间显著延长(P<0.05). 结论 毕赤酵母菌表达弓形虫GRA1蛋白免疫小鼠后可诱导特异性抗体产生,CD4+淋巴细胞增殖不明显,而CD8+淋巴细胞则显著增殖及对弓形虫攻击感染有一定的保护作用.
