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冷冻保存对正常和不育症精子PH-20表达和凋亡的影响
目的 探讨冷冻保存对人精子膜蛋白PH-20表达和精子凋亡的影响.方法 14例正常生育力精液标本(A组)和20例不育症精液标本(B组)行冷冻保存.Western blotting检测PH-20蛋白在人精子中的表达,免疫荧光用来观察PH-20蛋白在人精子上的定位,应用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的原位末端标记(TUNEL)法检测精子凋亡情况.结果 解冻后正常生育组和不育组的PH-20/β-actin平均吸光度与冷冻前比较均有显著性下降(P＜0.05);解冻后正常生育组和不育组的PH-20阳性率与冷冻前比较均有显著性下降(P＜0.05).解冻后正常生育组的精子凋亡率与冷冻前的比较差异无显著性意义(P＞0.05).而解冻后不育组的精子凋亡率与冷冻前的比较均显著性下降(P＜0.05),且不育组的降低程度大于正常生育组.结论 冷冻-解冻过程可引起精子PH-20蛋白表达减少和精子PH-20阳性率降低,但冷冻保存对正常生育者的精子凋亡率无显著影响.
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精子特异性透明质酸酶PH-20结构与功能
精子表面特异性透明质酸酶(PH-20)是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的单链膜蛋白,特异性分布于精子头部浆膜和顶体内膜,是一种多功能蛋白,在受精过程中具有重要作用.鉴于PH-20在精子表面的特异性分布及其在受精中的作用,PH-20作为免疫避孕候选疫苗对象一直受到关注.继续深入研究PH-20的结构与功能,将有助于全面揭示精卵结合的分子过程.
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脂质体介导基因转染人精子膜蛋白PH20DNA疫苗质粒向小鼠骨骼肌导入
目的:精子膜蛋白PH-20分布在精子表面,在受精过程中起重要作用,可作为免疫避孕候选疫苗.采用脂质体介导基因转染法将pcDNA3.1(+)-hPH20DNA疫苗质粒导入小鼠骨骼肌中,检测目的基因hPH-20在体内的表达水平.方法:实验于2006-06/2007-02在郑州大学解剖学实验室完成.①清洁级健康BALB/C小鼠12只,随机数字表法分为重组质粒组、空载体组、生理盐水组,4只,组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.已构建好的pcDNA3.1(+)-hPH20重组质粒由本室保存.②实验方法:质粒提取后,用精胺盐酸去除内毒素,鲎试剂榆测晕阳性代表去除成功.取少量质粒行琼脂糖电泳鉴定纯度,用紫外分光光度计测量质粒DNA的含量.每只小鼠于股四头肌分点注射利多卡因预处理3 d.重组质粒组将脂质体包裹的peDNA3.1(+)-hPH20 DNA缓慢注射于股四头肌内,200μg/只.空载体组单纯将pcDNA3.1(+)缓慢注射到股四头肌内,200 μ g/只.生理盐水组于相同部位缓慢注射等鼍生理盐水.重组质粒组分别于注射后第4,7,11,16天以断颈法各处死1只小鼠,空载体组、生理盐水组小鼠均于注射后第11天同法处死.迅速取股内侧肌肉30mg,研磨成粉末状,RT-PCR法检测目的基因hPH-20 mRNA在体内的表达.结果:①提取质粒琼脂糖凝胶电泳检测结果:提取的质粒成功去除内毒素后,琼脂糖凝胶电泳显示质粒纯度较高,绝大部分处于超螺旋状态,有利于体内转基因的表达.紫外分光光度计测量质粒DNA的含量(A 260/A280)为1.8～2.0.②目的基因hPH-20mRNA体内表达RT-PCR检测:重组质粒组注射后第4天即可检测到1530 bp特异性条带,第7天表达增强,第11天达到高峰,第16天表达下降.空载体组、生理盐水组各时间点均未见特异性条带.结论:脂质体介导基因转染法能够高效将peDNA3.1(+)-hPH20 DNA疫苗质粒导入小鼠骨骼肌中,且hPH-20基因于注射后11 d呈峰值表达.
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冷冻保存对人精子膜蛋白PH-20和透明质酸酶活性的影响
目的:探讨冷冻保存对人精子膜蛋白PH-20和顶体内透明质酸酶活性的影响.方法:24例正常生育力精液标本行冷冻保存.免疫印迹检测PH-20蛋白在人精子中的表达,免疫荧光观察PH-20蛋白在人精子上的定位,采用改良透明质酸钠-明胶底物膜法检测精子顶体内透明质酸酶(HYD)活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度).结果:免疫印迹显示正常标本冷冻前、后精子均有PH-20蛋白的表达,其PH-20/β-actin平均光密度在正常组冷冻前为0.41±0.15;正常组解冻后为0.24±0.11,两者的平均光密度差异有统计学意义;间接免疫荧光染色后在荧光显微镜下观察冷冻前PH-20阳性率达72.88％±8.04％;解冻后PH-20阳性率降至46.97％±8.38％,差异有统计学意义;解冻后HYD活性与冷冻前比较均有显著性下降.结论:冷冻-解冻过程可引起精子PH-20蛋白表达减少和精子PH-20阳性率降低,以及受精过程中的关键酶-HYD活性减弱.
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NIH3T3细胞及小鼠骨骼肌中人PH-20基因疫苗的表达
目的:研究人PH-20基因疫苗在体内外的表达.方法:以脂质体介导基因转染法将pcDNA3.1(+)-hPH-20基因疫苗导入MH3T3细胞中,RT-PCR和原位杂交检测hPH-20 mRNA的表达.以脂质体介导基因转染法将疫苗接种于BALB/C小鼠后腿股内侧肌,分别于接种后第4、7、11、16天取小鼠股内侧肌进行RT-PCR检测.结果:体外转染的NIH3T3细胞阳性克隆经RT-PCR检测,可见1530 bp目的条带;原位杂交结果显示阳性细胞胞浆中可见蓝紫色颗粒.取注射基因疫苗后的小鼠注射部位肌肉以RT-PCR法检测到1 530 bp的目的条带,空载体及生理盐水对照组未见目的条带.结论:人PH-20基因疫苗体内外均可表达.
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透明质酸酶对人乳腺癌细胞MDA231增殖和转移的影响
目的观察透明质酸酶(PH-20)基因对人乳腺癌细胞在鸡胚胎中生长和转移的影响.方法 PH-20 cDNA转染到人乳腺癌细胞株MDA231中(MDA231-PH20),细胞种植到鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)上,观察肿瘤大小;对肿瘤组织血管内皮细胞染色,研究肿瘤新生血管生长变化;PCR扩增远端CAM中Alu DNA序列,观察PH-20对肿瘤细胞转移的影响.结果 MDA231-PH20在CAM上增殖的程度明显高于对照组,血管内皮细胞数量也增多,同时远端CAM出现Alu DNA序列,而对照组无.结论 PH-20明显促进癌组织内新生血管生长,并促进乳癌细胞增殖和远端转移.
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新方法制备的PH-20疫苗的鉴定及其避孕效果观察
目的 观察以等比方法配制的PH-20偶联体疫苗以直肠方式注射后对豚鼠的免疫避孕效果.方法 45只雌性豚鼠随机分为3组,每组15只,实验1组注射新研发的PH-20疫苗,实验2组注射纯化的PH-20蛋白,而对照组注射等体积的生理盐水.用电镜观察该偶联体疫苗形态,Bradfords法测定免疫刺激复合物(ISCOM)中PH-20蛋白结合量,用竞争ELISA技术分别于注射后第2、4、6、8周检测血液中PH-20特异性抗体的水平.结果 ISCOMmat-PH-20偶联体疫苗呈典型的蜂窝状,颗粒直径28～32 nm,ISCOMmat-PH-20偶联体中PH-20的结合量约为0.057 9 mg/mL,实验1组血液中的PH-20特异性抗体水平在第2、4、6、8周与实验2组、对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05).实验1组PH-20特异性抗体含量在第2、4、6周逐渐升高(P<0.05),而PH-20特异性抗体含量第8周与第6周相比,差异无统计学意义(P＞0.05).实验2组在第2、4、6周时,PH-20特异性抗体水平与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05),但组内第2、4、6周之间比较差异无统计学意义(P＞0.05),而PH-20特异性抗体含量从第6周开始下降,第6周与第8周相比差异有统计学意义(P<0.05),第8周与对照组相比无明显变化(P＞0.05).直肠注射8周后,实验1组与实验2组的雌性豚鼠的受孕率差异有统计学意义(2=52.84,P<0.05).结论 该偶联体疫苗具有较高的免疫活性,能诱导机体产生明显的体液反应,且持续时间较长,获得的避孕效率明显升高.
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透明质酸酶PH-20和肿瘤
肿瘤的发生、增殖和转移与细胞外基质(ECM)有着密切的关系,透明质酸(HA)是细胞外基质中含量多、所占体积大的组份,而透明质酸酶(HAase)能特异性地分解透明质酸,从而在肿瘤发生发展中发挥重要作用.目前,人类基因组中已经发现6个透明质酸酶样序列HYAL1、HYAL2、HY-AL3、HYAL4、HYALP1、PH-20(SPAM1),它们形成2个紧密的结构,分别位于染色体3p21.3(前3种)和7q31.3(后3种),编码的透明质酸酶具有组织特异性,行使不同的功能[1],其中HYAL1、HYAL2、PH-20为重要.研究证明,PH-20在许多正常组织和肿瘤中均有表达,且与肿瘤演进相关,本文就PH-20与肿瘤的关系及研究进展做一综述.
