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人精子膜蛋白P34H表达与透明质酸酶活性的关系
目的 探讨人精子膜蛋白P34H表达和顶体内透明质酸酶活性的关系.方法 收集88例精液标本,其中正常生育组20例,不育男性68例.参照世界卫生组织(WHO)标准对标本进行精液常规分析,根据精液参数的不同,将68例不育标本分为正常精液参数不育组和精液参数异常不育组.Western blotting检测P34H蛋白在人精子中的表达,免疫荧光观察P34H蛋白在精子表面的阳性表达率,采用改良透明质酸钠-明胶底物膜法检测精子顶体内透明质酸酶(HYD)活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度).结果 正常精液参数不育组和精液参数异常不育组的精子P34H/β-aetin平均吸光度、精子P34H标记阳性率均明显低于正常生育组,经统计学分析差异均有显著性(P＜0.05);正常精液参数不育组和精液参数异常不育组的HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)与正常生育组比较均有显著下降(P＜0.05).相关性分析提示,精子P34H蛋白表达量与HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)存在正相关性,相关系数r=0.449、0.431,P＜O.01;精子P34H阳性率与HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)存在正相关性,相关系数r=0.727、0.691,P＜0.01.结论 男性不育患者精子P34H蛋白表达减少,精子P34H阳性率降低以及HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)减弱.
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不育男性精子膜蛋白P34H的表达与中性α-糖苷酶活性的关系
目的:探讨男性不育患者精子膜蛋白P34H的表达与精浆中性α-糖苷酶(NAG)活性的关系.方法:收集精液标本,分为正常生育组和不育组.参照WHO标准方法对标本进行精液常规分析,免疫印迹检测P34H蛋白在人精子中的表达,免疫荧光观察P34H蛋白在人精子上的定位,采用底物酶法检测精浆NAG活性.结果:免疫印迹结果显示,正常生育组的精子P34H蛋白表达和精子P34H阳性率均显著高于不育各组;精子P34H蛋白表达及阳性率在NAG活性正常组与NAG活性异常组差异无统计学意义.相关性分析提示精子P34H蛋白表达及P34H阳性率与精浆NAG活性呈正相关性.结论:精子P34H蛋白表达减少、精子P34H阳性率降低以及NAG活性减弱均会导致男性生育力低下,附睾精子蛋白P34H量和NAG活性可用于评价男性生育能力.
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抗人精子表面蛋白P34H单克隆抗体的制备与鉴定
目的:制备并鉴定抗人精子表面蛋白P34H的单克隆抗体(McAb).方法:以重组P34H蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术建立分泌抗P34H McAb的细胞株,并制备腹水型McAb,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western印迹鉴定其敏感性及特异性.结果:获得1株(2C4)IgG1 Kappa型抗P34H McAb.ELISA结果表明腹水型McAb效价可达1:103～1:105,Western印迹显示该McAb既能特异性地结合精子膜蛋白中相对分子质量(Mr)约为34 000的天然抗原,又能特异性地结合Mr约为27 000重组P34H蛋白.结论:用上述方法成功制备抗P34H McAb,为进一步研究P34H与男性生殖的关系奠定了基础.
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人精子表面蛋白P34H重组表达载体的构建及诱导表达
目的:获得纯化的人精子表面蛋白P34H用于基础和临床研究.方法:在克隆到P34H基因编码区全长的基础上,将P34H基因亚克隆至原核表达载体pQE-30中,构建重组表达载体pQE-30/P34H.将pQE-30/P34H转化至大肠埃希菌后,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过Ni-NTA树脂进行亲和层析纯化上清中可溶性形式的重组蛋白P34H.对表达纯化重组蛋白的质粒进行DNA测序,并对重组蛋白P34H行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,鉴定其是否为所需目的蛋白.结果:经PCR和双酶切鉴定,重组表达载体pQE-30/P34H为正确克隆.SDS-PAGE和DNA测序证实,所获的重组蛋白确系所需目的蛋白.结论:用上述原核表达的方法可获得纯化的人精子表面蛋白P34H.
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人精子表面蛋白P34H的基因克隆及其在睾丸和附睾中表达分析
目的:克隆精子表面蛋白P34H基因的编码区,为进一步体外表达P34H蛋白做准备.方法:提取人附睾体部总RNA,并以此为模板,进行反转录PCR获得编码P34H蛋白的基因片段.应用T/A克隆策略,将扩增的P34H基因编码区克隆入T载体,并通过双酶切和DNA测序进行鉴定.同时,以β-actin为内参照物,进行反转录PCR半定量分析,比较P34H在附睾头部、体部和尾部及睾丸组织中的表达量.结果:成功地克隆了P34H基因.将P34H的cDNA序列登录GenBank,登录号为AF515625.反转录PCR半定量分析表明P34H主要在附睾体部表达.结论:克隆的P34H基因可用于构建表达载体.
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附睾精子蛋白P34H与男性生殖
哺乳动物精子在附睾转运过程中会获得精-卵相互作用所必需的精子表面蛋白.P34H是由人附睾上皮细胞分泌并定位于精子顶体的精子膜蛋白,属于短链脱氢酶/还原酶(SDR)超家族成员.初步研究表明,P34H能够介导精子-卵透明带的结合,可作为附睾精子成熟的标志物,且低水平的附睾精子蛋白P34H与原发性男性不育显著相关.因此,精子表面P34H的水平可以作为男性不育症的一个辅助诊断指标.本文对附睾精子蛋白P34H的分子生物学特性、基因的表达与调控、作用机理及其与男性生殖的关系作一综述.
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梗阻性无精子症患者附睾蛋白P34h的表达及其意义
目的:探讨梗阻性无精子症患者的附睾组织中附睾蛋白P34h mRNA及蛋白表达情况,并探讨其在梗阻性无精子症患者中的意义.方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测30例因不同梗阻(输精管或射精管水平梗阻)所致的梗阻性无精子症患者附睾组织中P34h基因mRNA的表达水平,Western Blot检测2组P34h蛋白的表达.结果:2组均有P34h mRNA的表达,输精管梗阻的P34h/β-actin均值为0.418±0.045,射精管梗阻的P34h/β3-actin均值为0.719±0.069,输精管梗阻的附睾组织中P34h mRNA水平显著低于射精管梗阻(P＜0.05).2组亦均有P34h蛋白的表达,输精管梗阻平均光密度为0.095±0.014,射精管梗阻为0.276±0.054(P＜ 0.05),两组P34h蛋白的表达差异有统计学意义.结论:P34h mRNA及其蛋白在不同梗阻因素所致的无精子症患者的附睾中表达水平有明显差异,提示P34h可能是梗阻性无精子症时导致精子成熟障碍的一个重要因素.
