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人源性抗HBsAg单链Fab基因在酵母中的表达
抗乙肝表面抗原的人源性抗体(Fab)在临床上有防治乙型肝炎病毒的应用前景,如用于预防新生儿乙型肝炎病毒的垂直传播和治疗性乙肝制剂等.本文将噬菌体抗体库筛选得到的人源性抗HBsAg Fab抗体基因,通过重叠PCR的方法借Linker将Fab的轻链(L链)和重链(H链)融合构建单一的链,即单链Fab(Single chain Fab)基因,并插入到酵母表达载体pPICZαA中.将构建的表达载体质粒pPICZαA-HL线性化,通过LiCl转化法转化毕赤酵母GS115,利用ZeocinTM抗生素筛选重组酵母,并用高剂量的ZeocinTM平板来筛选多拷贝整合有融合L、H链基因的重组酵母.
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4种方法比较检测新鲜和陈旧标本中的结核分枝杆菌
我们应用抗酸染色、细菌培养、荧光染色、聚合酶链反应(PCR)4种方法分别检测陈旧标本和新鲜标本中结核分枝杆菌,并作比较分析如下.一、材料与方法1.标本来源:120份标本来自1996年10月～1997年4月长治医学院附属和平医院传染科结核患者的痰、脑脊液、胸腹水等并置于灭菌青霉素小瓶中.当即对其中43份标本处理,取每份标本的1/2做抗酸染色、细菌培养、荧光染色、PCR检测.其余的1/2留在容器中放4℃冰箱,直至1999年10月再用4种方法检测.2.抗酸染色、细菌培养按实验室常规方法操作.荧光染色试剂金胺0-罗丹明,结核分枝杆菌在背景中呈现金黄色荧光.PCR根据TB多拷贝插入序列S6110自行设计的寡
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90例弥漫性大B细胞淋巴瘤的分子遗传学及预后意义初探
目的:分析90例弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)的临床病理学特征及其临床意义.方法:收集90例DLBCL石蜡包埋组织标本及预后资料,采用免疫组织化学技术及间期荧光原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization,FISH)技术研究其免疫表型和分子遗传学特征.结果:本组病例中,70例原发于淋巴结外,20例原发于淋巴结.根据Hans模型,42.2％ (38/90)的DLBCL起源于生发中心B细胞(GC),57.8％(52/90)起源于非生发中心B细胞(Non-GC).IGH、bcl-6、bcl-2及c-myc基因易位的阳性率分别为33.3％ (30/90)、22.2％(20/90)、4.4％(4/90)和3.3％(3/90);bcl-2、bcl-6、c-myc及IGH基因多拷贝的阳性率分别为51.1％(46/90),40％ (36/90)、30％(27/90)和14.4％ (13/90).20例bcl-6基因易位的DLBCL中,14例为Non-GC起源,6例为GC起源;4例bcl-2基因易位的病例中,3例为GC起源,1例为Non-GC起源;3例c-myc基因易位的病例中,2例为GC起源,1例为Non-GC起源.结外DLBCL的IGH基因易位的阳性率高于结内者(P＜0.05);结内DLBCL的c-myc基因多拷贝的阳性率高于结外者(P＜0.05).本组29例有随访结果的病例显示,IGH、bcl-6、bcl-2及c-myc基因易位及多拷贝与预后无明显相关(P＞0.05).结论:本组DLBCL总的分子遗传学异常率(包括因易位及拷贝数的异常)为82.2％,其中以bcl2多拷贝(51.1％)为多见.不存在IGH、bcl-6、bcl-2及c-myc基因异常,不能除外DLBCL的诊断.少部分DLBCL中存在Burrkitt淋巴瘤特征性的c-myc基因易位.IGH、bcl-2、bcl-6及c-myc基因易位及拷贝数的异常在DLBCL中不具有的预后判定意义.
关键词： 弥漫性大B细胞淋巴瘤 易位 多拷贝 -
人血清白蛋白融合技术研究进展
结合笔者所在课题组的实验研究成果,综述人血清白蛋白融合技术研究进展.人血清白蛋白融合技术是近些年来应用较多的用于改造小分子蛋白和多肽药物的手段.但是众多的研究结果发现将小分子蛋白/多肽和人血清白蛋白融合后会出现一些共性的问题,例如目标蛋白产率低、易降解等.这些共性问题可以通过融合蛋白的优化设计、蛋白酶缺陷宿主的构建、融合基因多拷贝以及与分子伴侣共表达得以解决.
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PCR扩增IS6110在结核病检测和流行病学中的应用评价
插入序列6110(IS6110)是结核分支杆菌基因组中的一个多拷贝的保守片段.Thierry等在1990年首先报道了结核分支杆菌一个插入序列的核苷酸顺序,并命名为IS6110.IS6110中含有1 361bp的核苷酸和28 bp的反向末端重复序列,它属于插入序列IS3家族,并且只存在于结核分支杆菌复合群(Mycobacteria tuberculosis complex,MTC)中[1].
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微滴式数字PCR(ddPCR)快速检测α珠蛋白基因αααanti-3.7三联体
目的 建立一种基于微滴式数字PCR(ddPCR)技术的α珠蛋白基因αααanti-3.7快速检测方法.方法 以β-actin为参比基因、a1基因X1/Y1盒之间的差异性序列为目的基因代表性扩增子,设计特异性引物和TaqMan探针,建立基于ddPCR技术的拷贝数定量方法;检测28例已知基因型和60例临床样本,评价此方法的灵敏度和准确性.结果 采用本研究建立的方法,28例已知基因型样本的检测结果均与靶基因型结果相符;60例临床样本中检出5例αα/αααanti-3.7,与MLPA的验证结果一致;方法学评价结果显示此ddPCR体系的灵敏度与准确性均达100％.结论 建立了一种α珠蛋白基因aaαanti-3.7三联体ddPCR检测方法,操作简单快速、结果准确可靠,可应用于人群筛查和临床常规分子诊断.
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顺式串联家蝇抗菌肽Attacin基因真核表达载体的构建
目的构建家蝇抗菌肽Attacin基因多拷贝串联体,并克隆到甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K上.方法PCR法扩增家蝇抗菌肽Attacin基因成熟肽片断,目的片断的上游5'端带有EcoRⅠ和Nhe Ⅰ位点,下游5'端带有Not Ⅰ和XbaⅠ位点,目的片断首先克隆入pMD18-T载体,利用pMD18-T载体的Nde Ⅰ位点和目的片断上的一对同尾酶(Nhe Ⅰ和Xba Ⅰ),多次酶切连接,串联成多拷贝的Attacin成熟肽基因,再用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切,后克隆入甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K.结果PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证明串联体基因重组质粒构建成功.结论该方法能方便高效地获得所需的多拷贝基因,为进一步进行高效表达打下基础.
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抗菌肽Aurein1.2基因的同向串联及其克隆载体的构建和鉴定
目的: 构建抗菌肽Aurein1.2基因多拷贝串联体,并将目的基因串联产物克隆到载体pUC18上.方法: 分别合成含相同黏性末端的Aurein1.2单拷贝基因、EcoRⅠ前接头及SalⅠ后接头.单拷贝基因分别与前、后接头连接,通过控制基因和接头加入的量及时间,可得到两侧有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的同向串联的多拷贝基因,选取合适拷贝数的基因,将其克隆到载体pUC18上.结果: PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证明多拷贝基因重组质粒构建成功.结论: 该方法能方便高效地获得所需的多拷贝基因,为进一步克隆到表达载体并进行高效表达打下基础.
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基于二代测序技术分析多拷贝DYF404S1基因座遗传多态性初步研究
目的 基于二代测序技术(next generation sequencing,NGS)用于Y染色体多拷贝短串联重复序列(multi-copy short tandem repeat on Y chromosome,Multi-copy Y-STRs)DYF404S1分型方法建立及在河南汉族群体中遗传多态性分析的初步研究.方法 在DYF404S1基因座特异引物两端添加适宜的接头,得到带有不同接头的引物组合,共25组.采用BIOO RAPID DNA试剂盒构建二代测序文库,使用Illumina MiseqTM二代测序仪对225例河南汉族群体的男性样本进行测序,STRait Razor V2.0软件进行测序数据分析,同时与一代测序ABI3100遗传分析仪分型结果比对分析.结果 基于Illumina MiseqTM二代测序平台,采用引物两端加接头的方法对225例河南汉族无关男性个体样本进行DYF404S1基因座分型,其中220例成功分型,成功率达97.8％;同时使用3130遗传分析仪进行DYF404S1基因座分型,分型结果与二代测序分型结果一致.3例样本出现等位基因异常分型,均表现为3等位基因模式.DYF404S1基因座在河南汉族群体中的单体型多样性(haplotype diversity,HD)和个体识别力(discrimination power,DP)分别为0.9356和0.9311.结论 初步建立了NGS技术用于多拷贝DYF404S1分型方法,为法医学实践和群体遗传学提供了技术和理论基础.
关键词： 法医物证学 多拷贝 DYF404S1基因座 Y染色体 二代测序技术 -
长链非编码RNA、微小RNA、环状RNA在心脏性猝死疾病中的研究进展
近年来,心血管疾病在我国的发病率和死亡率逐年上升,是严重影响群众健康的重要疾病之一.尽管长期的研究使人们对心血管疾病有了一定的了解,但是其发病机制尚未完全清楚.长链非编码RNA、微小RNA和环状RNA均为具有调节功能的非编码RNA分子.研究表明,这些功能性非编码RNA不但在细胞增殖、分化和衰老过程中发挥着重要作用,还参与了癌症、神经退行性疾病和心血管疾病等疾病的病理进程.本文将着重概述长链非编码RNA、微小RNA和环状RNA在心血管疾病中的作用及其新研究进展.
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Y染色体多拷贝短串联重复序列及其法医学应用研究进展
Y染色体为男性所特有、呈父系遗传,Y染色体上短串联重复序列(short tandem repeat on Y chromosome,Y-STR)在法医学实践中有特殊的作用,诸如父系家族的亲权鉴定,混合斑男性成分的检测,不同男性个体混合物的分析、追溯父系迁移历史及重构同一父系家族等方向都具有独特的应用价值.然而,Y染色体上存在较多的重复回文区域,位于该区域的部分Y-STR基因座具有2个或以上拷贝,称为多拷贝Y-STR基因座,如DYS385a/b、DYS389 Ⅰ/Ⅱ等.除了具有Y-STR基因座所具有的一般特征外,多拷贝Y-STR基因座还具有其独特的遗传特点.本文就多拷贝Y-STR基因座的法医学应用及研究进展进行综合评述.
