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人源性噬菌体抗体库的构建和抗CEA抗体的筛选及表达
目的 构建人源性噬菌体抗体库,筛选和表达人源性抗癌胚抗原(CEA)单克隆抗体.方法 从结肠癌患者肠系膜淋巴结中的淋巴细胞克隆出免疫球蛋白Fd段和κ链基因,建成噬菌体抗体库.用人CEA对抗体库进行筛选,将得到的阳性克隆进行表达及检测.结果 抗体库库容为5.2×106,Fab基因重组率为30%.ELISA及Western blot分析检测,证实表达出人源抗CEA单克隆抗体.DNA序列测定,证实所获基因为人免疫球蛋白可变区基因.结论 成功构建噬菌体抗体库,从中获得人源性抗CEA的单克隆抗体.
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免疫抑制剂临床应用新进展
免疫抑制剂在防治移植排斥、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病、超敏反应引起的疾病和自身免疫性疾病的治疗中占据极重要的作用.在近 20 年中,免疫抑制剂有了一定的发展,并出现了许多新的免疫抑制药物,其中大部分已在临床上得到应用,本文就雷帕霉素、霉酚酸酯、他克莫司、FTY720 和人源性单克隆抗体等免疫抑制剂的作用机制,临床用途和不良反应等方面的进展作一总结,给临床合理用药提供帮助.
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人源性促甲状腺激素受体抗体Fab段抗体库的构建
目的 通过噬菌体表面展示技术,构建人源性促甲状腺激素受体抗体(TRAb)Fab片段抗体库.方法 从甲状腺功能亢进症患者外周血单个核细胞抽提总RNA,PCR法扩增免疫球蛋白分子轻链K、λ基因及重链Fd基因.构建轻链文库及组合文库.一个随机的组合文库在噬菌体表面表达.结果 从外周血单个核细胞中抽提得到总RNA,并反转录获得cDNA文库.PCR法扩增了大小约为680 bp的轻链K、λ基因及重链Fd基因,并构建了库容为1.32×105基因抗体库(轻链库)和库容为2.28×105 Fab抗体库(组合文库).Fab组合文库转化到大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞,在辅助噬菌体M13K07的辅助下,扩增得到噬菌体抗体库.结论 噬菌体表面展示技术可成功构建人源性TRAb Fab片段组合文库.
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人源抗CEA噬菌体抗体库的构建及筛选
目的构建人癌胚抗原(CEA)特异性噬菌体抗体库,制备人源抗CEA单克隆抗体(mAb).方法用常规RT-PCR法,直接从10例结肠癌患者肠系膜淋巴结中的淋巴细胞克隆出免疫球蛋白Fd段和κ链基因,建成噬菌体抗体库.对抗体库进行5轮吸附-洗脱-扩增的亲和选择后,以ELISA法鉴定抗CEA噬菌体.结果 RT-PCR可有效地扩增出Fd和κ基因并以此构建成容量为5.2×106的噬菌体抗体库.经5轮亲和选择可使特异性噬菌体抗体得到高度富集,并成功获得抗CEA噬菌体抗体阳性克隆.结论抗CEA噬菌体抗体库的构建和人源抗CEA mAb的制备,为CEA阳性表达肿瘤的靶向治疗奠定基础.
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人源性噬菌体抗体库中抗CEA单抗的筛选与初步鉴定
目的探讨利用噬茵体抗体库技术制备抗CEA的人源性单抗的可行性.方法以纯化的CEA为抗原,应用噬菌体表面呈现技术,通过3轮亲和富集及2轮淋巴细胞吸附实验,从已构建好的人源性噬茵体抗体库中筛选出抗CEA的人源性单抗,随机挑出10株单克隆在大肠杆茵中进行表达,并采用ELISA、SDS-PAGE及基因测序进行初步鉴定.结果ELISA显示有9株单抗具有与CEA特异性结合的能力,挑选其中2株具有较高亲和力的单克隆,经12%SDS-PAGE蛋白电泳,在分子量约为25kd处可见一新增蛋白带,与基因编码蛋白的理论计算值相符合,基因测序结果与Gene Bank等相比对具有较高的序列同源性.结论噬茵体抗体库技术是研制人源性单抗的有效途径.
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人源性噬菌体抗体库的构建及抗amylin抗体的初步筛选
目的:构建人源性噬菌体抗体库,从中筛选胰淀素(amylin)单克隆抗体(mAb),测定其特异性及抗原结合活性.方法:从正常健康人的外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PcR方法扩增人免疫球蛋白Fd段和轻链基因,构建噬菌体抗体库.酶切和PcR鉴定后,阳性克隆进行DNA测序分析.用人amylin抗原对抗体库进行筛选富集,将得到的阳性克隆进行Phage-ELISA鉴定,结果进行统计学分析.结果:终构建的抗体库库容约为0.8×108,酶切鉴定显示有插入片段,抗体库重组率为70％.阳性克隆进行DNA测序证实所获基因为人免疫球蛋白可变区基因.以amylin抗原进行3轮筛选,抗体库得到特异性富集.阳性克隆进行Phage-ELISA检测证实有良好的抗胰淀素抗原的特异性.结论:成功构建了一个人源性噬菌体抗体库,为从中获得人源抗amylin的mAb奠定了实验基础.
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人源抗癌胚抗原单克隆抗体的获得与鉴定
目的:获得抗癌胚抗原(CEA)的单克隆抗体(mAb).方法:采用特殊的5轮筛选法(逐轮降低抗原包被量,严格洗脱条件),以固相化的人源CEA抗原淘筛本室构建的人源特异性噬菌体抗体库.获得有特异结合活性的CEA噬菌体抗体,酶切鉴定插入的抗体基因.切去噬菌粒上衣壳蛋白gⅢ基因,构建表达载体,在大肠杆菌中可溶性表达抗CEA抗体Fab段,ELISA、Westem blot检测抗体免疫学活性,测序分析抗体基因.结果:筛选出4株与CEA抗原特异结合而与BSA、HBsAg无交叉结合反应的噬菌体抗体.切去gⅢ基因,在大肠杆菌中表达可溶性抗体Fab段,表达量在细菌培养液上清和细菌裂解液中无统计学意义.可溶性抗体与人CEA抗原有特异结合活性,与BSA、HBsAg无交叉结合反应.Western blot显示在略大于相对分子质量(Mr)45 000处有一明显条带,与Mr48000的Fab大小一致.DNA测序分析表明Fab段VH属于IgG VH3基因家族,VL属于Vk1基因家族.结论:抗CEA噬菌体抗体库的构建和人源抗CEA mAb的制备,为CEA阳性表达肿瘤的靶向治疗奠定基础.
