病毒学研究的新工具:脱氧核酶及其应用

脱氧核酶是利用体外分子进化技术,从随机脱氧核苷酸单链库中获得的一种具有酶活性的DNA分子.通过该技术已筛选出具有核酸酶活性、激酶活性、过氧化物酶活性等多种催化功能的脱氧核酶.本文概述了脱氧核酶的筛选方法、催化特点、设计策略及其作为一种新型的基因阻抑工具在病毒学研究等领域的广泛应用.

HCV脱氧核酶在荧光素酶表达细胞中活性的初步观察

脱氧核酶(deoxyribozyme,DRz)是具有生物催化活性的小分子酶性DNA(catalytic DNA),能定点剪切RNA分子,其活性中心系所谓10～23基序(motif).`

Egr-1的特异性脱氧核酶对大鼠颈总动脉损伤后新生内膜的影响

Egr-1特异的脱氧核酶对大鼠动脉损伤后血管内皮功能的影响

脱氧核酶抑制COX-2基因表达并促进人肝癌细胞的凋亡

目的 探讨利用脱氧核酶切割环氧化酶-2(COX-2)mRNA来抑制其基因表达以及对人肝癌细胞凋亡的影响.方法 合成针对COX-2基因的"10～23"型脱氧核酶及其类似物,提取人肝癌细胞总RNA在胞外切割COX-2 mRNA,检测其胞外切割活性;转染肝癌细胞,检测其在细胞内的切割活性及对细胞凋亡的影响.用RT-PCR检测COX-2和凋亡相关基因bcl-2、bax的mRNA水平,用荧光免疫方法测定相应的蛋白水平.结果 非修饰脱氧核酶DzT和修饰的脱氧核酶DzTi(在DzT的3'末端添加倒位连接的T碱基)在胞外切割反应中能够有效地切割COX-2 mRNA;在转染进入肝癌细胞后,DzTi比DzT显示更强的切割活性,显著地下调细胞内COX-2蛋白水平(P＜0.01)和bcl-2蛋白水平(P＜0.05),上调bax蛋白的表达(P＜0.01),抑制肝癌细胞的生长(P＜0.05).脱氧寡核苷酸DzT'和DzTi'是由对DzT和DzTi的催化区进行碱基替换而成,在胞外和胞内均不能切割COX-2mRNA和促进肝癌细胞的凋亡.结论 脱氧核酶能够有效切割COX-2 mRNA,抑制COX-2蛋白表达和促进肝癌细胞凋亡,有可能作为COX-2抑制剂用于医学临床.

脱氧核酶对Period1 mRNA的体外切割及对小鼠吗啡奖赏效应的影响

目的研究脱氧核酶对Period1 mRNA的体外切割作用,及注射脱氧核酶对阿片类药物奖赏效应的影响.方法设计合成针对Period1(Per1)mRNA的脱氧核酶(DRz164),并构建pcDNA3.1(+)-Per1164体外转录载体;将体外转录产物和脱氧核酶按一定条件混合,检测脱氧核酶的体外切割效率.脑室注射DRz164,建立小鼠条件位置偏爱模型,观察脱氧核酶对吗啡奖赏效应的影响.结果 DRz164对Per1 mRNA组分有切割作用,在反应30、60、90和120 min的剪切百分率分别为36.4%、40.5%、47.8%和63%.给予DRz164后小鼠未能形成对吗啡的位置偏爱.结论 DRz164在体外能够切割per1 mRNA,在一定范围内剪切活性随时间延长而升高,小鼠脑室注射DRz164可拮抗吗啡所引起的奖赏效应,缓解对吗啡的精神依赖.

基于登革2型病毒PrM基因的新型脱氧核酶对病毒RNA降解作用的初步观察

目的:针对登革2型病毒(DEN2)PrM基因设计新型脱氧核酶并观察其抗病毒作用.方法:根据脱氧核酶(DRz)裂解RNA靶位的特异性,选择DEN2 PrM基因中符合5'…R↓Y…3'(R=A/G,Y=U/C)特征且其二级结构中以未配对与配对碱基的磷酸二酯键为靶位,设计合成DEN2特异性脱氧核酶,筛选具有裂解PrM RNA活性的DRz.观察DRz与靶序列浓度比、Mg2+浓度及反应时间对DRz裂解效率的影响.结果与结论:体外裂解实验显示,在所设计合成的8个脱氧核酶中,DRz614对登革病毒的PrM RNA靶序列具有裂解活性,降解效率高达82%.本研究为进一步探讨新型抗登革病毒策略奠定了基础.

核酸药物的研究进展

从基因组的双链DNA (dsDNA),到编码和非编码RNA(mRNA、lncRNA和miRNA等),只要与疾病发生相关,都可能作为基因治疗的靶标.这些靶标可被替换、修复、补充、抑制或消除,取决于所采取的具体基因治疗方法.基因编辑技术是将致病基因裁剪缝补为正常的基因,而化学合成的和体内表达的核酸药物则主要靶向致病性RNA.与此同时,转运核酸药物的方法也在大力研发中,包括病毒或质粒表达载体和各种聚合物材料.核酸药物的成药性、转运载体的安全性和效率是基因治疗方法面临的挑战性问题.本文简要综述近年来基因治疗药物,特别是反义核酸、核酶、脱氧核酶、小干扰RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)等化学合成的核酸药物,以及化学修饰在提高核酸药物的效价、抗酶解稳定性和有效转运等关键技术方面的进展.随着对基因调控在疾病发生过程中认识的逐步深入和核酸药物优化技术的进步,核酸药物的研发步伐将会越来越快,期待包括siRNA药物在内的更多核酸药物在不久的将来应用于临床治疗.

脱氧核酶的研究进展

自发现groupⅠ内含子的自我切割和连接活性以来,已进行了大量关于核酸催化活性的研究.通过体外筛选技术又发现一些短的单链DNA具有化学催化活性,这些人工合成的DNA核酶,或称脱氧核酶,具有高效的催化活性和结构识别能力.迄今为止已发现了几十种脱氧核酶,至少能催化7种化学反应.其中特别的是一种能特异切割RNA的高效通用的脱氧核酶--10-23 DNA核酶.它包括一个催化结构域和两翼的识别结构域.迄今为止在脱氧核酶的应用方面,特别是作为基因表达抑制剂在基因治疗方面,取得了较大的进展.

核酶的研究进展

核酶是一类具有催化功能的核酸分子.对天然核酶的改造和人工核酶的筛选使核酶的催化反应谱得到了扩展,也为核酶作为基因治疗药物和核酸探针提供了多种选择.现综述核酶在基因治疗和靶基因识别等方面的研究进展,并提出目前核酶研究中存在问题及相关对策.针对各种致病基因,小型核酶和普适性脱氧核酶"10-23"在细胞水平显示了诱人的前景.随着有效的转运和表达方法的建立及核酸化学的进步,核酶将成为基因治疗方法之一.

基因体外转录的应用研究

大量研究表明,基因表达的调控发生在基因复制、转录、转录后、翻译和翻译后等环节上.而基因转录的调控是逐级调控中关键的环节.由于参与调控的因素有很多,调控的过程非常复杂,因此在体内自然条件下,对基因的转录情况进行研究比较困难.

脱氧核酶在肿瘤基因治疗中的应用

脱氧核酶是利用体外分子进化技术获得的一种具有酶活性的DNA分子.概述了脱氧核酶的结构特点、修饰和设计策略、催化特点、在基因治疗中的优势及作为一种新型的基因治疗工具在肿瘤治疗中的应用.

基因治疗新策略——酶性DNA的设计和应用

本文综述了能够剪切RNA分子的酶性DNA的种类、结构、作用机制、动力学特征及其在用作新型基因治疗药物方面的优势、设计要点、应用现状与前景等新研究进展.

核酶的化学修饰

核酶是一类具有催化核酸水解和连接功能的核酸分子,体外筛选技术的发展大大扩展了它的催化反应谱.进一步的化学修饰,如引入蛋白酶的催化性官能团和靶向结构,对于改善核酶的药学性质及发展临床应用的核酶药物具有指导意义.

早期生长反应因子1特异脱氧核酶对大鼠动脉损伤后血管内皮功能水平的影响

目的:探讨早期生长反应因子1(Egr-1)特异脱氧核酶(ED5)对实验性大鼠动脉损伤后血管内皮功能的影响.方法:Wistar大白鼠96只,随机分为假手术组、对照组1、对照组2和ED5治疗组各24只.行左颈总动脉内膜剥脱术,治疗组经带孔球囊导管末端将含有异硫氰酸荧光素标记的ED5 500μg、转染试剂FuGENE630μl的1mmol/L MgCl2液200μl局部加压注入损伤血管节段内,局部作用15 min.对照组1局部注入200μl的1 mmol/LMgCl2液.对照组2局部注入含30μl FuGENE6Reagent的1 mmol/L MgCl2液200μl.分别于3,7,14,21 d每组各处死动物6只,处死前心脏取血检测一氧化氮、一氧化氮合酶、内皮素浓度.结果:ED5治疗组血清一氧化氮和一氧化氮合酶含量均增高(P＜0.05);血浆内皮素浓度则有所降低(P＜0.05).结论:Egr-1特异脱氧核酶可改善动脉损伤后血管内皮功能.

脱氧核酶对肝癌细胞AFPmRNA表达的影响

目的 本研究针对AFPmRNA(甲胎蛋白mRNA)设计脱氧核酶,观察其切割AFPmRNA的有效性,探索脱氧核酶在肝癌基因治疗的可能性.方法 体外转录AFPmRNA底物,设计并合成DZ(脱氧核酶)、DZs(硫代修饰脱氧核酶,序列同DZ,但两侧各有两个脱氧核苷酸进行了硫代修饰)、ASO(反义寡聚脱氧核苷酸)、无关DZ对照.体外切割AF-PmRNA;经转染试剂将脱氧核酶转染入肝癌细胞HepG2,利用RT-PCR法检测AFPmRNA水平的变化;免疫细胞化学及图像分析系统检测AFP蛋白质表达情况;MTT法初步估计肝癌细胞的生长效应.结果 DZ与DZs在体外均可切割AFPmRNA底物;经转染DZ、DZs的细胞均下降AFPmRNA的水平,而且DZs的作用更强;经转染DZ与DZs的细胞均下降AFP的表达,ASO也略下降AFP的表达;DZ、DZs有抑制细胞生长的作用.结论 本实验设计的脱氧核酶能在细胞外有效切割AFPmRNA;在细胞内也能切割AFPmRNA、抑制AFP的表达、抑制肝癌细胞的生长,为肝癌的基因治疗提供可能性.

DNAzyme抑制H-ras基因表达的研究

目的研究DNAzyme特异切割H-ras mRNA的效率.方法针对H-ras mRNA序列,设计并合成了7个10-23DNAzyme,分别进行DNAzyme的细胞外酶切反应;通过荧光显微镜观察脂质体介导DNAzyme的转染效果,利用实时定量PCR、MTT法在细胞水平检测DNAzyme对H-ras基因表达的抑制.结果合成的7个10-23 DNAzyme均可以细胞外近生理条件下对H-ras mRNA进行有效切割.利用LipofectamineTM可将荧光标记的DNAzyme No.1转染Hep-2细胞.转染后DNAzyme在细胞核及细胞质内均存在,且在细胞质中多位于核周围.实时定量PCR检测,DNAzyme No.1在转染后24 h及48 h能显著降低Hep-2细胞中H-ras RNA的含量,从而抑制ras基因的表达.利用MTT检测到DNAzyme No.1在转染Hep-2细胞24 h及48 h后对细胞增殖及分化均产生明显的抑制作用.结论DNAzyme在细胞内外均能够有效抑制H-ras基因的表达.

二级结构模拟预测HBV脱氧核酶有效作用靶点

目的:通过二级结构模拟预测作用靶点,观察HBV特异性脱氧核酶的体外切割活性,探讨其用于抗病毒制剂的可能性.方法:以HBV X基因mRNA 序列为靶设计脱氧核酶DRz-X29,对其特异的切割活性进行体外实验.结果:特定反应条件下,DRz-X29成功对二级结构模拟预测的底物靶点进行了特异切割.结论:底物二级结构模拟能够有效预测HBV脱氧核酶作用靶点,为其发展成一种新型抗病毒制剂奠定了实验基础.

hTERT脱氧核酶对白血病细胞HL-60凋亡相关基因的影响

[目的]探讨hTERT脱氧核酶对白血病细胞(HL-60)凋亡相关基因表达的影响.[方法]合成针对hTERT mRNA的"10～23"型脱氧核酶及其类似物,转染白血病细胞后,用PCRELISA法测定端粒酶活性;RT-PCR和荧光免疫测定Bcl-2和Bax的表达.[结果]脱氧核酶DzT转染白血病细胞后,能够显著降低白血病细胞端粒酶活性(P＜0.01)和Bcl-2基因的表达(P＜0.05),抑制白血病细胞的生长(P＜0.05),上调Bax基因的表达(R＜0.05).[结论]脱氧核酶能降低白血病细胞的端粒酶活性,促进白血病细胞凋亡.

脱氧核酶抑制乙型肝炎病毒基因表达的实验研究

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)s基因和c基因特异性的脱氧核酶(DNAzyme)对HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)表达的抑制效应.方法:设计合成针对HBV s基因ORF A157UG、e基因ORF A1816UG的DNAzyme DrzBS、DrzBC,在2.2.15细胞上观察其对HBV s基因、c基因的表达抑制效应.结果:DrzBS、DrzBC作用于2.2.15细胞后,可显著抑制HBV s基因、c基因的表达,有效浓度为0.1～2.5 μmol/L并呈剂量依赖性,高抑制率分别为94.2%和91.8%;有效抑制持续时间可达72 h;DrzBS、DrzBC在细胞内对HbsAg、HbeAg表达的抑制效率,明显高于作为对照的反义寡核苷酸AsBS、AsBC,有效浓度较后者低至少10倍.其对2.2.15细胞的HBV DNA复制无明显影响,亦未见明显的细胞毒性作用.结论:在2.2.15 HBV细胞模型系统,DrzBS、DrzBC能高效阻断HBV s基因、e基因的表达,是一种特异性的、高效的抗HBV基因治疗剂.