首页 > 文献资料
-
一种功能性分离和纯化胶质瘤干细胞的方法
目的 探索一种简单、高效、稳定、可靠、经济的胶质瘤干细胞分离和纯化方法. 方法 取对数生长期U87细胞,应用无血清干细胞培养基,置含1％O2的缺氧培养箱中培养,10d后传代培养并离心收集第一代肿瘤球(G1),连续传代培养获得第5代肿瘤球(G5).免疫组化染色检测G5肿瘤球中巢蛋白(nestin)、CD133和缺氧诱导因子2α (HIF2α)的表达;Western blotting检测G1～G5肿瘤球中HIF2α蛋白的表达;免疫细胞化学染色检测G5分化细胞中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、O1及βⅢ微管蛋白(βⅢ-Tublin)的表达.6只裸鼠按随机数字表法均分为实验组和对照组(每组3只),于左侧背部皮下分别注射105个/5 μL G5、U87细胞,25 d后处死裸鼠,取出肿瘤,免疫组织化学染色检测肿瘤中nestin的表达. 结果 G5肿瘤球中nestin、CD133、HIF2α阳性细胞率分别为91％±5％、95％±4％和98％±2％; Western blotting检测显示G1～G5肿瘤球中HIF2α蛋白的表达逐渐增加;G5细胞能分化为表达βⅢ-Tublin、GFAP、O1的子细胞;6只裸鼠均长出肿瘤,实验组的肿瘤体积较大,且肿瘤组织nestin阳性细胞率(47％±11％)明显高于对照组(5％±2％). 结论 使用功能性分离和纯化方法获得的G5肿瘤球细胞,表达胶质瘤干细胞的特异性标记物、具有三系分化能力和较强的体内成瘤能力,符合胶质瘤干细胞的特征.
-
伽玛刀对脑胶质瘤干细胞增殖和凋亡影响的研究
目的 探讨伽玛刀治疗对胶质瘤干细胞增殖和凋亡的影响. 方法 无血清悬浮培养胶质瘤干细胞,RT-PCR检测CD133的表达,荧光染色检测胶质瘤干细胞分化后细胞巢蛋白(nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、β-微管蛋白的表达.10Gy伽玛射线处理胶质瘤干细胞、U87细胞48 h后显微镜下观察细胞存活数;15 Gy伽玛射线处理胶质瘤干细胞8～10h后免疫荧光染色检测5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)阳性细胞;流式细胞仪检测10、15Gy伽玛射线处理前后胶质瘤干细胞凋亡的变化. 结果 胶质瘤干细胞呈球形悬浮生长于培养基中,表达CD133和nestin,能够分化为星形胶质细胞和神经元,说明获得的胶质瘤干细胞具有分化能力.10 Gy伽玛射线处理同等密度的胶质瘤干细胞、U87细胞后U87细胞大量死亡,胶质瘤干细胞大部分存活,比较差异有统计学意义(86± 3vs 22±2,P＜0.05);15 Gy伽玛射线照射后,胶质瘤干细胞的BrdU阳性细胞率低于照射前,差异具有统计学意义[(35±0.8)％vs(22±0.8)％,P＜0.05)];用不同剂量的伽玛射线处理后细胞均发生凋亡,但凋亡率很低,高剂量组凋亡率(15 Gy,0.312±0.011)高于低剂量组(10 Gy,0.112±0.014),差异具有统计学意义(P＜0.05). 结论 在无血清培养基培养条件下,人体胶质瘤组织能够培养出胶质瘤于细胞.伽玛刀治疗能够抑制胶质瘤干细胞的增殖,引起其凋亡,并呈剂量相关性.和胶质瘤细胞相比较,胶质瘤干细胞对伽玛刀不敏感,存在放疗抵抗性.
-
Rac1在脑胶质瘤干细胞迁移和侵袭中的作用
目的 通过特异性的Racl活性抑制剂下调胶质瘤干细胞(GSCs)中Rac1的活性,探讨Rac1在GSCs迁移和侵袭中的作用. 方法 将U251细胞置于无血清DMEM/F12干细胞培养基中培养,免疫磁珠分选法分离GSCs,免疫荧光染色检测CD133鉴定GSCs; Rac1活性实验检测CD133+与CD133-细胞活性,Transwell细胞迁移和侵袭实验评价CD133+与CD133-细胞的迁移和侵袭能力;加入Rac1活性抑制剂NSC23766处理GSCs,活性实验检测细胞Racl活性,Western blotting检测hMena和基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表达；Transwell细胞迁移实验和侵袭实验评价细胞迁移和侵袭能力的改变. 结果 成功培养出悬浮生长的细胞球,可以连续传代并持续表达神经干细胞标志物CD133；CD133+细胞Rac1-三磷酸鸟苷(GTP)表达水平、细胞迁移和侵袭的能力显著高于CD133-细胞,差异有统计学意义(P＜0.05)；与对照组比较,NSC23766处理组GSCs的Rac 1-GTP、hMena和MMP-9蛋白表达水平明显降低,迁移和侵袭能力明显减弱,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 GSCs相对于肿瘤中的其他细胞具有更强的迁移和侵袭能力,Rac1对脑GSCs的迁移和侵袭具有调控作用,抑制Rac1活化可能成为治疗恶性胶质瘤的新策略.
-
全反式维甲酸对胶质瘤干细胞VEGF和bFGF表达的影响
目的 研究全反式维甲酸(ATRA)对胶质瘤干细胞(GSCs)血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响. 方法 从人胶质母细胞瘤细胞系U87中分离培养GSCs,免疫荧光染色检测CD133、巢蛋白(nestin)的表达进行鉴定.将取GSCs分成3组分别培养:(1)ATRA组:培养基中含10 nmol/L ATRA;(2)空载体组:培养基中含与ATRA组等量的二甲基亚砜(DMSO)；(3)对照组:单纯培养基,培养10 d后免疫荧光染色检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)、半乳糖脑苷脂(GalC)的表达；CCK8法检测各组细胞的增殖；ELISA和RT-PCR分别检测各组GSCs VEGF、bFGF的分泌水平和mRNA的表达. 结果 二代细胞球表达神经干细胞(NSCs)的标记抗体CD133和nestin.免疫荧光染色检测显示分化后GSCs能够分化为多种同源子代细胞(分别表达星形胶质细胞、神经元、少突胶质细胞标志物GFAP、β-tubulinⅢ、Galc);培养10d后ATRA组细胞GFAP的阳性表达率高于对照组及空载体组,差异有统计学意义(P＜0.05).第3.～7天ATRA组细胞增殖速度较对照组和空载体组明显变缓,差异有统计学意义(P＜0.05)；分化24 h后ATRA组GSCs VEGF、bFGF的分泌水平和mRNA的表达均少于对照组和空载体组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 ATRA能诱导GSCs分化并抑制其增殖,其可能通过抑制VEGF和bFGF的表达发挥抗胶质母细胞瘤的作用.
关键词： 全反式维甲酸 胶质瘤干细胞 分化 血管内皮细胞生长因子 碱性成纤维细胞生长因子 -
干细胞在胶质瘤治疗中的研究进展
依据肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)生物特性,肿瘤被认为是正常干细胞经受了“转变”,而仍保留有自我更新和不定分化潜能的细胞无限增殖形成的产物.有实验证实,少量胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)即可驱动胶质瘤恶性增殖,并耐受放、化疗[1].因此,若治疗能特异性针对GSCs,杀灭GSCs可控制胶质瘤复发.神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是一类可自我更新,定向分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多能干细胞.NSCs移植可修复神经损伤,其主要作用是:(1)增殖分化从而替代受损细胞功能,重建神经环路[2];(2)分泌神经营养因子(NTFs),如脑源性神经营养因子(BDNF)和胶质源性神经营养因子(GDNF),发挥营养神经促神经修复作用[3];(3)神经干前体细胞具有免疫调节功能,可调控肿瘤相关炎症反应发挥抗瘤生长作用[4].
-
胶质瘤血管起源细胞的研究现状:血管新生和血管发生两种观点的碰撞
众所周知,胶质瘤血管的形成在胶质瘤发生、进展和转移过程中发挥至关重要的作用,若没有胶质瘤自身血管的形成,胶质瘤无法维持其持续、快速的生长.然而,形成胶质瘤血管的细胞来自何方尚有争议,虽然早在30多年前,已由Folkman[1]提出的假说所阐明,他认为胶质瘤细胞诱导增生的宿主血管内皮细胞是胶质瘤血管的细胞来源,该假说影响深远,至今仍广为接受.但相关研究远不止于此,近年来有报告认为其来源于宿主骨髓造血干细胞[2],骨髓间充质干细胞[3],或是来源于肝、肠[4]的内皮祖细胞(EPCs),甚至是胶质瘤细胞本身[5-6],都可能参与了肿瘤血管的生成,其中也包括笔者新近报道的胶质瘤干细胞转分化为肿瘤血管内皮细胞[7],但该研究领域至今仍存在争议,如近有报道称,骨髓源性间充质干细胞能够通过抑制血管新生,从而抑制胶质瘤生长[8].本文结合笔者的实验数据和国内外的研究进展,对胶质瘤血管内皮细胞的起源综述如下.
-
成球实验在胶质瘤干细胞培养中的局限性及未来展望
在过去的十多年中,肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)成为癌症研究的新热点.CSC理论认为,肿瘤细胞具有异质性,而对肿瘤的发生、发展起决定性作用的仅仅是其中的一小部分细胞.这一小部分细胞与正常组织中的干细胞同样具有两个关键特性:自我更新和多向分化潜能[1-3].CSC由此得名.自从1995年Bonnet和Dic[4]从急性非淋巴细胞性白血病中发现CSC以来,人类已经在乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、肺癌等多种肿瘤中发现CSC[5-8].
-
胶质瘤干细胞放疗耐受机制研究进展
近年来随着肿瘤干细胞学说的提出.越来越多的研究表明,多种类型的胶质瘤组织中存在少数具有自我更新、多向分化、较强增殖潜能的细胞,即胶质瘤于细胞(glioma stem cells,GSCs),该学说认为GSCs是胶质瘤的种子和源泉,并把临床上恶性脑胶质瘤综合治疗失败的现象解释为综合治疗并没有将GSCs全部杀死.
-
胶质瘤干细胞与胶质瘤非干细胞生物学特性的差异性研究
目的 探讨胶质瘤干细胞(GSC)与胶质瘤非干细胞(nGSC)在生物学特性及相关蛋白表达方面的差异.方法 体外培养GSC1、GSC2及nGSC1、nGSC2,培养2、4、6、8、10和12 d后采用CCK8法检测4种细胞的增殖能力;培养2 d后采用CCK8法检测细胞对替莫唑胺(TMZ)的敏感性;粘附实验检测细胞的粘附能力;Transwell实验检测细胞的迁移、侵袭能力;明胶酶谱实验检测细胞分泌基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的活性;Western blotting、免疫荧光染色检测细胞Notchl、表皮生长因子受体(EGFR)蛋白的表达.结果 培养4、6、8、10和12 d时nGSC1细胞存活率均高于GSC1,nGSC2细胞存活率均高于GSC2,差异均有统计学意义(P<0.05);TMZ对GSC1、nGSC1和GSC2、nGSC2的半数抑制浓度(IC50)分别为(1536.0±17.67)μmol/L、(514.5±13.44)μmol/L,(2543.0±39.87)μmol/L、(889.6±17.43)μmol/L;GSC1粘附于细胞外纤维链接蛋白、胶原蛋白I的细胞数均多于nGSC1,GSC2粘附于纤维链接蛋白、胶原蛋白I的细胞数均多于nGSC2,差异均有统计学意义(P<0.05);GSC1迁移12、24 h的细胞数均多于nGSC1,GSC2迁移12、24 h的细胞数均多于nGSC2,差异均有统计学意义(P<0.05);GSC1侵袭24、36 h的细胞数多于nGSC1,GSC2侵袭24、36 h的细胞数多于nGSC2,差异均有统计学意义(P<0.05);GSC1分泌MMP-2的活性高于nGSC1,GSC2分泌MMP-2的活性高于nGSC2,差异均有统计学意义(P<0.05);Western blotting检测显示GSC1中EGFR/Notch1蛋白相对表达量低于nGSC1,GSC2中EGFR/Notch1蛋白相对表达量低于nGSC2,差异均有统计学意义(P<0.05);免疫荧光染色结果与Western blotting检测结果一致,EGFR蛋白在nGSC中强表达,在GSC中弱表达.Notch1蛋白在GSC中强表达,在nGSC中弱表达.结论 相对于高表达EGFR并具有较强增殖能力的nGSC,高表达Notch1的GSC分泌的MMP-2活性高,具有更强的粘附、迁移、侵袭能力,这可能是胶质瘤治疗抵抗和复发的重要原因.
-
胶质瘤干细胞诱导间充质干细胞恶性转化的实验研究
目的 探讨移植瘤中作为肿瘤间质细胞的骨髓间充质干细胞(BMSCs)和胶质瘤干细胞SU3-红色荧光蛋白(RFP)的相互作用. 方法 应用6 Gy X线辐射Balb/c裸小鼠损毁骨髓,尾静脉移植源于绿色荧光蛋白(GFP)裸小鼠的骨髓细胞,建立骨髓损毁重建模型;将SU3-RFP细胞接种骨髓损毁重建模型小鼠皮下并获取移植瘤,HE染色并用激光共聚焦显微镜观察.原代培养移植瘤,克隆出高增殖力的GFP+细胞,免疫细胞化学染色检测该细胞和BMSCs中CD44、Sca1、CD90和CD45的表达.CCK-8法、细胞克隆形成实验、Transwell侵袭实验分别检测高增殖力GFP+细胞、BMSCs、SU3-RFP的增殖能力、克隆形成率和侵袭能力;染色体核型分析该细胞、正常BMSCs有丝分裂相的染色体形态;将高增殖力GFP+细胞接种于Balb/c裸小鼠皮下,收获肿瘤组织并行HE染色. 结果 SU3-RFP细胞对骨髓损毁重建模型小鼠的致瘤率为100％(7/7).HE染色移植瘤显示血管丰富,管腔内可见红细胞.激光共聚焦显微镜下显示绿色的外源性移植骨髓细胞与红色的肿瘤干细胞相互作用活跃.免疫荧光染色显示高增殖力GFP+细胞与BMSCs均高表达CD44、弱表达Sca1和CD90、不表达CD45,将其命名为已转化的BMSCs(tBMSCs).CCK-8法、细胞克隆形成实验、Transwell侵袭实验检测显示SU3-RFP、tBMSCs的吸光度(A)值(培养后5、6、7 d)、克隆形成率、穿膜细胞数均高于BMSCs,差异有统计学意义(P＜0.05).染色体核型分析显示tBMSCs分裂相染色体较BMSCs明显增多;tBMSCs对Balb/c裸小鼠致瘤率为100％(5/5).HE染色可见肿瘤细胞呈浸润性生长,血供丰富. 结论 胶质瘤干细胞可诱导移植瘤中BMSCs的恶性转化,后者参与肿瘤重构.
-
胶质瘤干细胞与微环境中骨髓间充质干细胞或巨噬细胞融合的鉴定及生物学特性分析
目的 观察胶质瘤干细胞与其微环境中骨髓间充质干细胞(BMSCs)或巨噬细胞(Mo(o))能否发生融合,并鉴定融合细胞的相关表型. 方法 将红色荧光蛋白(RFP)基因稳定转染的人胶质瘤干细胞株SU4-RFP和源于表达绿色荧光蛋白(EGFP)的Balb/c裸小鼠BMSCs和M(o)共培养,激光共聚焦显微镜下观察SU4-RFP与BMSCs、M(o)间的融合,分别命名为F-BMSCs、F-M(o),单克隆高增殖力的RFP/EGFP双阳性细胞,用荧光标记的原位杂交技术(FISH)、Western blotting分别检测SU4-RFP、F-BMSCs、F-M(o)和BMSCs中RFP、EGFP基因和蛋白的表达;免疫细胞化学染色检测SU4-RFP、BMSCs、M(o)和F-BMSCs、F-M(o)分子标记物的表达;染色体核型分析检测SU4-RFP、BMSCs、F-BMSCs有丝分裂相的染色体形态;克隆形成实验、CCK-8法和Transwell实验分别检测F-BMSCs、F-M(o)、SU4-RFP的增殖能力和侵袭能力. 结果 激光扫描共聚焦显微镜下观察显示融合细胞表达红、绿2种荧光.FISH、Western blotting检测显示F-BMSCs、F-M(o)共表达RFP、EGFP2种基因和蛋白.免疫细胞化学染色显示SU4-RFP细胞仅巢蛋白(Nestin)表达阳性.BMSCs仅CD105和CD44表达强阳性,M(o)细胞仅CD68表达阳性;F-BMSCs共表达Nestin和CD105、CD44,F-M(o)共表达Nestin和CD68.染色体核型分析显示F-BMSCs的染色体核型中小鼠的端着丝粒染色体占大多数,同时可见少量人的中着丝粒染色体.F-BMSCs、F-M(o)的克隆形成率高于SU4-RFP,差异有统计学意义(P＜0.05).CCK-8实验显示F-BMSCs、F-M(o)的生长速度高于SU4-RFP;Transwell侵袭实验显示F-BMSCs、F-M(o)的穿膜细胞数(429.4±17.9、421.6±14.6)高于SU4-RFP(216.2±22.6),差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 肿瘤干细胞可与宿主BMSCs或M(o)自发融合,且融合后细胞恶性程度更高,提示其可能为肿瘤恶性进展的机制之一.
-
miR-124过表达诱导胶质瘤干细胞分化作用研究
目的 探讨miR-124过表达诱导胶质瘤干细胞分化作用的机制. 方法 构建miR-124过表达慢病毒载体并转染人胶质瘤干细胞,以正常培养的胶质瘤干细胞为对照,采用MTT法检测细胞增殖活性,采用流式细胞仪分析干细胞表型,采用RT-PCR检测miR-124及其靶基因Akt、RelA表达水平,采用ELISA法分析其信号通路中炎性因子白介素-1(IL-1)、IL-8分泌水平.结果 成功构建了miR-124过表达慢病毒载体并成功转染了人胶质瘤干细胞获得pGC-miR-124-GSCs.与正常培养的胶质瘤干细胞比较,pGC-miR-124-GSCs增殖能力明显降低,CD133阳性率明显下降,miR-124表达水平明显升高,Akt、RelA表达水平均明显下降,IL-1、IL-8分泌水平均明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 miR-124过表达诱导了胶质瘤干细胞分化,产生强烈的抑瘤活性,其机制可能与抑制炎性因子生成有关.
-
人脑胶质瘤干细胞SU2耐辐射实验研究
目的 探讨人脑胶质瘤干细胞SU2对辐射的耐受性及可能机制. 方法 U251细胞常规培养,SU2细胞分别在无血清DMEM/F12培养基、含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中培养后得到悬浮干细胞球(SU2)和贴壁分化细胞(SU2-FBS).U251、SU2、SU2-FBS接受0、2、10、15Gy剂量X线照射后24 h流式细胞仪检测侧群细胞(SP)、CD133+细胞比例;接受0、2、4、6、8Gy剂量照射1周后绘制剂量存活曲线,确定放射敏感性参数,即细胞经2GyX线照射后的存活分数(SF2);Balb/C裸鼠35只分为SU2干细胞移植组、SU2-FBS移植组、空白对照组,前2组又都分为3个亚组(n=5),分别脑内原位接种受照过0、10、20 GyX线的1×106个细胞/5 μL SU2干细胞悬液和SU2-FBS细胞悬液,空白对照组注入5μL生理盐水,21d后解剖取脑,HE染色观察致瘤情况并计算肿瘤体积,免疫组织化学染色检测肿瘤巢蛋白(nestin)、毛细血管扩张性共济失调突变(ATM)蛋白的表达. 结果 SU2干细胞中SP、CD133+细胞比例随着辐射剂量的提高而增加,SP细胞从5.63％±0.71％增加到22.05％±3.33％; CD 133+细胞由4.60％±0.82％增至17.89％±1.33％,差异有统计学意义(P＜0.05);SU2干细胞的生存曲线位于其他细胞的上方,对辐射的抗拒性(SF2=0.71±0.03)比SU2-FBS (SF2=0.54±0.04)和U251 (SF2=0.57±0.04)要高,差异有统计学意义(P＜0.05).与0GySU2-FBS移植组比较,0、10 Gy SU2干细胞移植组小鼠移植瘤体积较大,差异有统计学意义(P＜0.05),nestin、ATM的阳性表达较强. 结论 体外培养的胶质瘤干细胞SU2与同类分化细胞SU2-FBS相比具有更强的耐辐射性,这与其高表达ATM有关.
-
组蛋白去乙酰化酶抑制剂apicidin对胶质瘤干细胞生物活性的影响
目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂apicidin介导的Nanog表达抑制对胶质瘤干细胞(GSCs)增殖、迁移和侵袭能力的影响. 方法 人胶质瘤细胞系U87体外常规培养,应用无血清悬浮培养法获得GSCs,免疫荧光染色检测细胞CD133、巢蛋白(nestin)的表达进行鉴定;以0.5μmol/L apicidin处理GSCs 48 h作为实验组,以未经处理的GSCs作为空白对照组,RT-PCR和Western blotting分别检测2组细胞apicidin靶基因Nanog mRNA和蛋白的表达;免疫荧光双重染色检测GSCs中CD133和Nanog蛋白的表达;噻唑蓝(MTT)比色法检测0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mLapicidin对细胞增殖的抑制作用;Transwell实验检测apicidin对细胞迁移和侵袭能力的影响. 结果 由U87胶质瘤细胞系成功获得CD133、nestin表达阳性的GSCs;与空白对照组相比,实验组细胞中Nanog mRNA和蛋白的表达显著减少,Nanog+、CD133+以及Nanog+/CD 133+细胞阳性率均显著降低,细胞的迁移[迁移细胞数:(87.50±4.65)个/视野vs(128.50±6.14)个/视野]和侵袭能力[穿膜细胞数:(55.75±4.79)个/视野vs(81.50±5.45)个/视野)]下降,差异有统计学意义(P＜0.05); MTT比色法显示不同浓度apicidin组GSCs细胞的吸光度(A)值较空白对照组降低,抑制率增加,而且apicidin浓度越高,GSCs细胞的A值越低,抑制率越高,比较差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 组蛋白去乙酰化酶抑制剂apicidin可抑制靶基因Nanog mRNA和蛋白水平表达,从而抑制GSCs的细胞增殖、迁移和侵袭能力.
关键词： 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 NANOG 神经胶质瘤 胶质瘤干细胞 -
红色荧光基因慢病毒转染人脑胶质瘤干细胞的实验研究
目的 建立体外稳定表达红色荧光蛋白(RFP)的人脑胶质瘤干细胞.方法 将含有RFP基因的慢病毒(RFP-lentivirus)转染体外培养的人脑胶质瘤干细胞SU2,荧光显微镜下观察红色荧光表达情况;流式细胞仪测定转染前SU2细胞、转染后RFP-SU2细胞传代培养20代后红色荧光转染率:动态观察RFP-SU2单细胞的分裂及克隆形成情况；免疫荧光染色检测RFP-SU2细胞CD133、nestin的表达.结果 RFP-SU2呈悬浮球状生长,RFP呈高表达.转染前SU2细胞的红色荧光转染率仅为1.5％,转染并克隆培养20代后RFP-SU2细胞红色荧光转染率达75％.RFP-SU2单细胞仍可增殖形成脑肿瘤干细胞球,具有自我更新和克隆增殖能力.免疫荧光染色检测显示RFP-SU2细胞中CD133、nestin表达阳性.结论 以RFP为生物标记物的人脑胶质瘤干细胞成功建立,可为将来人脑胶质瘤干细胞的深入研究提供理想的材料.
-
干扰素-α/β体外增敏替莫唑胺对MGMT阳性胶质瘤干细胞作用
[目的]探讨干扰素是否能增加替莫唑胺(TMZ)对O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)阳性胶质瘤干细胞的抗肿瘤作用及其可能机制.[方法]采用“悬浮克隆球形成法”对常规培养条件下MGMT阴性表达的胶质瘤细胞株U251、SKMG-4进行诱导,获得MGMT阳性的胶质瘤干细胞U251G、SKMC-4G;应用CCK-8法检测干扰素-α和干扰素-β联合替莫唑胺对MGMT阳性胶质瘤干细胞的杀伤效应；分别应用逆转录PCR(RT-PGR)、Western-blot检测干扰素-α/β作用后,MGMT阳性胶质瘤干细胞MGMT、NF-kB表达的变化.[结果]应用悬浮克隆球形成法,成功将U251、SKMG--4诱导为具有干细胞特征的胶质瘤干细胞U251G、SKMG-4G,Western-blot检测显示胶质瘤干细胞中MGMT蛋白表达明显增高.对MGMT阳性胶质瘤干细胞生长抑制实验显示,干扰素-α/β作用后提高了替莫唑胺的化疗敏感性,杀伤效应显著增强；RT-PCR、Westerrn-blot检测结果表明,干扰素-α/β作用后,MGMT阳性胶质瘤干细胞NF-kB、mGMT在mRNA及蛋白水平表达均明显降低.[结论]对于MGMT阳性的胶质瘤干细胞,干扰素-α/β能够显著增加替莫唑胺的抗肿瘤效应,其机制可能是干扰素-α/β干预后,下调NF-KB的表达,从而降低了MGMT的转录表达,逆转替莫唑胺的化疗耐药.
-
Nrf2在胶质瘤干细胞和胶质母细胞瘤细胞系中的差异表达
目的：研究胶质瘤干细胞中 Nrf2的表达变化及其入核表达情况，寻找胶质瘤干细胞治疗的新靶点。方法：分别用 Western 和 qPCR 从蛋白和 RNA 转录两个层次比较胶质母细胞瘤细胞系以及胶质瘤干细胞的 Nrf2表达的差异，使用免疫荧光染色初步探讨 Nrf2的活化入核情况。结果： U87和 U251裸鼠种植瘤中胶质瘤干细胞的比例分别为1．24％和1．63％。胶质瘤干细胞中的 Nrf2含量高于胶质瘤细胞系，mRNA 含量也存在相同的差异。免疫荧光显示胶质瘤干细胞中入核的 Nrf2较高。结论：Nrf2信号通路是胶质瘤干细胞功能的潜在调控因子。
-
CD133、CD68和PD-L1在不同病理级别脑胶质瘤组织中的表达及相关性
目的 探讨人脑胶质瘤组织中胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)标志物CD133、肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)标志物CD68和负性共刺激分子PD-L1在不同病理级别人脑胶质瘤组织中的表达及其相关性.方法 采用免疫荧光双染法检测不同病理级别脑胶质瘤组织中CD68和PD-L1蛋白的共表达情况;采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time fluorescent PCR,qRT-PCR)技术检测30例低级别脑胶质瘤(Ⅰ级和Ⅱ级)组织和30例高级别脑胶质瘤(Ⅲ级和Ⅳ级)组织中CD133、CD68和PD-L1 mRNA的表达,并分析其与临床病理级别之间的相关性.结果 脑胶质瘤组织中PD-L1和CD68共表达在肿瘤相关巨噬细胞上,即大部分PD-L1阳性细胞为肿瘤相关巨噬细胞,高级别组CD68和PD-L1蛋白的共表达明显高于低级别组.在脑胶质瘤组织中,CD133、CD68和PD-L1 mRNA的表达水平均与病理分级呈正相关(r=0.647,P＜0.001;r=0.499,P＜0.001;r=0.445,P=0.001);三者在高级别脑胶质瘤组织中的表达均高于低级别脑胶质瘤组织(P＜0.05);脑胶质瘤组织中CD133与CD68 mRNA的表达呈正相关(r=0.525,P＜0.001),低级别组和高级别组中两者表达亦呈正相关(r=0.518,P=0.005;r=0.500,P=0.007);脑胶质瘤组织中CD133与PD-L1mRNA表达呈正相关(r=0.431,P＜0.001),低级别组和高级别组两者表达亦呈正相关(r=0.398,P=0.036;r=0.417,P=-0.027).结论 脑胶质瘤组织中PD-L1主要由肿瘤微环境中的TAMs表达;CD133、CD68和PD-L1表达与脑胶质瘤的恶性程度密切相关.
-
声动力对胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞治疗作用的对比研究
目的 比较声动力对胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞(GSCs)的治疗效果及影响机制.方法 由U251胶质瘤细胞分离、培养GSCs;随机分为对照组、声敏剂组、超声辐照组及声动力治疗组;应用MTT法和TUNEL法分析和比较各组间胶质瘤细胞和GSCs的活力和凋亡情况;利用DCFH-DA染色、流式细胞术分析各组间细胞内活性氧(ROS)的产量;利用流式细胞术、Western blot分析三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2(ABCG2)在胶质瘤和GSCs上的表达.结果 对照组、声敏剂组及超声辐照组中胶质瘤细胞和GSCs之间在细胞活力和凋亡比较差异无统计学意义.声动力治疗组中,GSCs较胶质瘤细胞内ROS相对产量更高[(7.43±1.33)倍vs.(4.33±0.85)倍];细胞活力更低[(20.37±3.76)％ vs.(43.37±4.66)％];凋亡率更高[(63.43±8.07)％ vs.(38.85±10.24)％],差异均有统计学意义(均P＜0.01).流式细胞术和Western blot结果表明,GSCs的ABCG2蛋白表达水平较胶质瘤细胞更高(P＜0.01).结论 与胶质瘤细胞相比,GSCs的声动力治疗效果更好,而在GSCs表面高度表达的ABCG2蛋白则是影响声动力对GSCs治疗效果的主要原因.
-
多药耐药基因MGMT在脑胶质瘤干细胞中表达的实验研究
目的:探讨甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(Methylguanine-dna methyltransferase,MGMT)在脑胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞(Brain glioma stem cells,BGSC)中的表达情况.方法:由手术切除的多形性胶质母细胞瘤中分离培养胶质瘤细胞和BGSC;应用免疫细胞化学染色和流式细胞术(Flow cytometry,FCW)鉴定BGSC;应用RT-PCR法测定MGMT mRNA在胶质瘤细胞、BGSC和正常脑组织中的表达.结果:本研究中获得的BGSC具有典型的BGSCs细胞生物学特征和免疫学标记；RT-PCR检测结果表明MGMT mRNA在BGSC中的相对表达量明显高于胶质瘤细胞(0.562±0.021 vs 0.112±0.023,P＜0.01),而胶质瘤细胞MGMTmRNA的相对表达量明显高于正常脑组织(0.112+0.023 vs 0.005±0.001,P＜0.01).结论:多药耐药基因MGMT主要在BGSC而非胶质瘤细胞中表达,其可能是BGSC产生多药耐药性的主要分子机制之一.
关键词： 胶质瘤干细胞 胶质瘤细胞 甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶
