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胶质瘤干祖细胞可诱导宿主脑胶质细胞癌变
目的 探讨可移植性人癌组织重构过程中,肿瘤干细胞植入方与宿主受体间的关系.方法 将红色荧光蛋白(RFP)基因稳定转染于已建株的胶质瘤干祖细胞SU3,再将建立的SU3-RFP细胞接种于表达绿色荧光蛋白(GFP)的裸小鼠脑内.取移植瘤组织,筛选高增殖力GFP细胞,单克隆化后,鉴定细胞类型,测定其DNA含量,行染色体显带分析.并将建系的GFP细胞H1和H9分别接种于裸小鼠腋下和颅内,观察致瘤率和癌性表型.结果 在可移植性肿瘤组织中,RFP、GFP和RFP/GFP细胞的比例分别为(88.99±1.46)％、(5.59±1.00)％和(4.11±1.02)％.经2次单克隆化的宿主GFP细胞株H1和H9,在体外表现出无限增殖、接触抑制消失、超四倍体等癌细胞特征,并表达少突胶质细胞特异性标志蛋白2’,3’-环腺苷酸-3’-磷酸二酯酶(CNP).H1和H2细胞的体内致瘤率均为100％,肿瘤均向接种周围组织呈广泛侵袭性生长.结论 在可移植性胶质瘤模型中的肿瘤细胞,并非像传统观点那样均由移植的肿瘤干祖细胞产生,被接种的肿瘤干细胞侵袭的宿主脑细胞也可以转化为肿瘤细胞.
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胶质瘤干细胞可诱导宿主肝组织内胶质瘤间质细胞恶性转化
目的 在已报道的原位移植的胶质瘤间质细胞可发生恶性转化的基础上,进一步探索该转化的发生是否依赖肿瘤部位特异性微环境.方法 将转有红色荧光蛋白(RFP)基因的人胶质瘤干/祖细胞SU3-RFP接种于全身表达绿色荧光蛋白(GFP)的裸小鼠肝脏,致瘤后取移植瘤组织做常规病理检测和细胞培养,单克隆具永生化的GFP+,GFP+/RFP+细胞传代,做细胞表型分析和致瘤实验.结果 SU3-RFP的移植成功率约83％,经异位生长的移植瘤组织再培养获得永生化的间质细胞.已建立B4,B9,B10三株单克隆细胞株,其中BB4为共表达GFP/RFP的融合细胞,还同时表达CD1a、CD83、CD86等树突状细胞标志蛋白;B9表达GFP和巨噬细胞标志蛋白CD68、F4/80;B10表达GFP和成纤维细胞标志蛋白FAP-α、α-SMA、S100均为鼠源宿主细胞.3株细胞遗传学检测都是异倍体,在裸小鼠皮下致瘤率均为100％.结论 在裸小鼠肝组织内建立的胶质瘤异位移植模型中,胶质瘤间质细胞也能恶性转化,表明这种恶性转化在中枢神经系统之外亦能发生,而且由间质细胞恶性转化可引起肿瘤异质性,这对进一步研究肿瘤发生、演进与肿瘤微环境的关系具有重要意义.
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胶质瘤干细胞微环境间质细胞恶性转化及相关分子特征分析
目的 探讨胶质瘤干细胞(GSC)诱导TME中多种间质细胞的恶性转化及其相关分子特征.方法 将红色荧光蛋白(RFP)基因稳定转染人SU3-RFP的GSC与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因裸小鼠间质细胞体外共培养,将SU3-RFP细胞接种于EFGP-Balb/c裸小鼠不同部位,从体外培养基与体内肿瘤组织中分别单克隆具永生化特征的EGFP+细胞,经染色体分析和致瘤试验证实其具有肿瘤细胞特征,再以RT-PCR、流式细胞术和细胞免疫化学染色等分子手段检测相关分子表型.结果 (1)体外培养共得到2株EGFP+细胞系,体内致瘤实验共得到5株EGFP+细胞系,所克隆的7株EGFP+细胞具自我更新、呈异倍体染色体核型和100％致瘤率;(2)根据细胞标志物表达状况鉴定其分别起源于巨噬细胞(tMΦ1和tMφ2)、树突状细胞(tDC1和tDC2)、成纤维细胞(tFB)、少突胶质细胞(tOG)和骨髓间充质干细胞(tBMSC);(3)根据七株细胞共同表达Sca-1(髓源性干细胞标志物)和c-myc,分别表达Sox2、Nanog等诱导性多能干细胞(iPS)标志物,确定这些恶性转化细胞不同程度上兼具髓源干细胞和iPS细胞的分子特征.结论 (1)TME中肿瘤间质细胞自身恶变与GSC对TME组织重构相关,与其寄生地组织类型关系不大;(2)源于GSC的肿瘤细胞和GSC TME中恶变的间质细胞,是GSC重构的肿瘤组织内两大类不同起源的肿瘤细胞,由此构成广义肿瘤异质性概念的细胞学基础,后者有潜力作为靶向诊疗的新靶标.
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双色荧光示踪裸小鼠模型用于脑胶质瘤组织重构的研究
目的 探讨双色荧光示踪裸小鼠模型用于脑胶质瘤组织重构研究的实用价值.方法 将转染红色荧光蛋白基因(RFP)的SU3、U87-MG和用亲脂性碳青染料(CM-DiI)染色的C6胶质瘤细胞6.7×109/L,借助立体定向仪接种于自家培育的表达绿色荧光蛋白(GFP)近交系裸小鼠脑内,建立RFP/GFP双色荧光示踪的肿瘤模型,分析示踪效果.结果 SU3、U87-MG和C6转染或染色成功的比例接近100％,这些细胞原位移植成功率为100％(30/30);移植瘤组织重构是在侵袭于脑实质、脑室、脑血管的肿瘤细胞诱导或与宿主细胞融合后发生的.结论 在肿瘤组织重构研究中,双色荧光示踪模型对区别肿瘤细胞与宿主细胞之间发生的组织细胞学变化起独特作用.
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胶质瘤干细胞与微环境中骨髓间充质干细胞或巨噬细胞融合的鉴定及生物学特性分析
目的 观察胶质瘤干细胞与其微环境中骨髓间充质干细胞(BMSCs)或巨噬细胞(Mo(o))能否发生融合,并鉴定融合细胞的相关表型. 方法 将红色荧光蛋白(RFP)基因稳定转染的人胶质瘤干细胞株SU4-RFP和源于表达绿色荧光蛋白(EGFP)的Balb/c裸小鼠BMSCs和M(o)共培养,激光共聚焦显微镜下观察SU4-RFP与BMSCs、M(o)间的融合,分别命名为F-BMSCs、F-M(o),单克隆高增殖力的RFP/EGFP双阳性细胞,用荧光标记的原位杂交技术(FISH)、Western blotting分别检测SU4-RFP、F-BMSCs、F-M(o)和BMSCs中RFP、EGFP基因和蛋白的表达;免疫细胞化学染色检测SU4-RFP、BMSCs、M(o)和F-BMSCs、F-M(o)分子标记物的表达;染色体核型分析检测SU4-RFP、BMSCs、F-BMSCs有丝分裂相的染色体形态;克隆形成实验、CCK-8法和Transwell实验分别检测F-BMSCs、F-M(o)、SU4-RFP的增殖能力和侵袭能力. 结果 激光扫描共聚焦显微镜下观察显示融合细胞表达红、绿2种荧光.FISH、Western blotting检测显示F-BMSCs、F-M(o)共表达RFP、EGFP2种基因和蛋白.免疫细胞化学染色显示SU4-RFP细胞仅巢蛋白(Nestin)表达阳性.BMSCs仅CD105和CD44表达强阳性,M(o)细胞仅CD68表达阳性;F-BMSCs共表达Nestin和CD105、CD44,F-M(o)共表达Nestin和CD68.染色体核型分析显示F-BMSCs的染色体核型中小鼠的端着丝粒染色体占大多数,同时可见少量人的中着丝粒染色体.F-BMSCs、F-M(o)的克隆形成率高于SU4-RFP,差异有统计学意义(P＜0.05).CCK-8实验显示F-BMSCs、F-M(o)的生长速度高于SU4-RFP;Transwell侵袭实验显示F-BMSCs、F-M(o)的穿膜细胞数(429.4±17.9、421.6±14.6)高于SU4-RFP(216.2±22.6),差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 肿瘤干细胞可与宿主BMSCs或M(o)自发融合,且融合后细胞恶性程度更高,提示其可能为肿瘤恶性进展的机制之一.
