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B细胞淋巴瘤LITAF基因甲基化状态及其临床意义
目的 探讨B细胞淋巴瘤中LITAF基因启动子区CpG岛异常甲基化情况,研究去甲基化药物对人B细胞淋巴瘤细胞系Raji、Pfeiffer和Daudi细胞中LITAF基因的转录调控作用,寻找肿瘤治疗新靶点.方法 收集存档石蜡包埋组织标本105例[弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL) 54例,小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)15例,黏膜相关淋巴组织结外边缘区淋巴瘤(MALT)8例,滤泡性淋巴瘤(FL)6例,其他22例],5例良性反应性增生淋巴组织作为正常对照.甲基化特异性PCR(MSP)检测LITAF基因启动子区甲基化状态.运用MSP、Western blot、免疫组织化学方法检测5-氮杂脱氧胞苷处理前后Raji、Pfeiffer和Daudi细胞系的甲基化状态及蛋白表达情况.四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测经去甲基化药物处理后细胞生长抑制情况.结果 B细胞淋巴瘤中89.5％(94/105)的病例存在LITAF基因启动子区高甲基化,其中3.8％ (4/105)的病例发生完全高甲基化,22.9％(24/105)的病例以部分非甲基化为主,对照组5例良性淋巴结增生标本中LITAF基因启动子区均未检测到高甲基化改变.经去甲基化处理后,Raji、Daudi、Pfeiffer细胞LITAF基因甲基化程度明显受抑制,基因表达得以恢复和增加.结论 在B细胞淋巴瘤患者中普遍存在LITAF基因启动子区CpG岛高甲基化,由其所致的LITAF基因表达沉默或减少可能是B细胞淋巴瘤发生的一个重要因素,LITAF基因的高甲基化可望作为一个良好的候选分子诊断标记及可能的治疗靶点.
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组蛋白去乙酰化酶2表达下调对喉鳞癌Hep-2细胞凋亡和增殖及迁移的影响
目的 探讨组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)表达下调对喉鳞癌Hep-2细胞增殖、细胞凋亡和细胞迁移的影响.方法 利用脂质体2000将HDAC2小干扰RNA (siRNA)和对照siRNA转染喉鳞癌Hep-2细胞,将细胞分为3组:未处理组、siRNA对照组和HDAC2 siRNA转染组.利用Westernblot检测转染HDAC2 siRNA后喉鳞癌Hep-2细胞中HDAC2蛋白的表达;利用CCK-8分析3组细胞增殖的变化;采用流式细胞术检测3组细胞凋亡情况;接着利用Boyden小室研究3组细胞迁移能力的变化,后采用Westem blot研究与细胞凋亡和细胞迁移密切相关蛋白的表达.结果 HDAC2siRNA明显下调喉鳞癌Hep-2细胞中HDAC2蛋白的表达.HDAC2表达下调明显抑制喉鳞癌Hep-2细胞的增殖和诱导细胞凋亡,并抑制喉鳞癌Hep-2细胞的迁移.此外,HDAC2表达下调明显增加caspase-3和caspase-9的表达,但降低基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表达.结论 HDAC2可能在喉鳞癌发生发展中发挥重要作用,其表达下调介导的细胞凋亡和迁移抑制可能与caspase-3和caspase-9表达的升高以及MMP-2和MMP-9表达的降低相关.
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弥漫性大 B 细胞淋巴瘤中 PRDM 1基因甲基化状态与预后的相关性
目的：探讨弥漫性大B细胞淋巴瘤（ DLBCL）组织中PRDM1基因启动子甲基化状态与免疫分型及预后的相关性，初步揭示该基因甲基化在DLBCL发生发展中的作用机制。方法选取初治DLBCL石蜡包埋组织100例，反应性增生淋巴结20例作为对照。免疫组织化学EnVision法检测CD20、CD10、bcl－6、bcl－2、PRDM1／Blimp－1、MUM1蛋白表达，根据Hans分型法分型。甲基化特异性聚合酶链反应（ MSP）法检测肿瘤组及对照组中PRDM1基因启动子甲基化状态并分析其与临床特征之间的关系。应用阳离子脂质体试剂转染法介导的小干扰RNA转染OCI－Ly1（ GCB型）和OCI－Ly3（ ABC型）细胞系，逆转录PCR和Western blot方法检测siRNA转染前后细胞系中PRDM1／Blimp－1的表达情况。单因素生存分析（ Kaplan－Meier）法分析PRDM1基因启动子甲基化及各临床特征与生存期之间的关系。结果100例DLBCL 患者中， GCB 型27例（27％）， ABC 型73例（73％）。 PRDM1／Blimp－1在DLBCL组阳性表达21例（21％），反应性增生淋巴结中广泛阳性（100％）。 PRDM1基因启动子甲基化在肿瘤组共有23例（23％），而对照组中均为非甲基化，两者之间差异有统计学意义（P＝0．004）。 PRDM1基因启动子甲基化在不同年龄段、性别、Ann Arbor分期、血清乳酸脱氢酶水平、国际预后指数、免疫分型等临床病理参数之间无明显相关性。沉默表达siRNA转染细胞系，逆转录PCR和Western blot结果显示PRDM1／Blipm－1在转染组表达较空白对照组及阴性对照组下降。单因素生存分析显示在年龄≥60岁、功能状态（ PS ）评分3～4分、有B症状组DLBCL患者生存率明显较低。结论在DLBCL患者中存在PRDM1基因启动子区CpG岛甲基化，由其所致的PRDM1基因表达沉默或减少可能是DLBCL发生的一个重要因素。体外沉默siRNA转染OCI－Ly1和OCI－Ly3细胞系，证实PRDM1基因在DLBCL中起到抑癌基因作用，PRDM1基因甲基化有望作为一个候选分子诊断标志物及可能的治疗靶点。
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KIAA0101在胃癌细胞中的表达及其对胃癌MKN-45细胞增殖和侵袭力的影响
目的 研究胃癌细胞中KIAA0101蛋白的表达,并探讨其表达下调对胃癌MKN-45细胞增殖、细胞周期和侵袭力的影响.方法 利用Western blot检测3株胃癌细胞系(MKN-28、SGC-7901和MKN-45)中KIAA0101蛋白的表达.将KIAA0101小干扰RNA(siRNA)和对照siRNA分别转染胃癌MKN-45细胞,利用Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)检测细胞增殖的变化,利用流式细胞术检测细胞周期分布的改变,后采用Boyden小室检测细胞侵袭力的变化.结果 胃癌MKN-45细胞中KIAA0101蛋白的相对表达水平显著高于MKN-28和SGC-7901细胞,3组之间差异有统计学意义(P＜0.05).CCK-8结果显示,与未处理组和对照siRNA组相比,KIAA0101 siRNA组中胃癌MKN-45细胞的增殖受到明显抑制(P＜0.05).细胞周期分析结果显示,KIAA0101 siRNA组[ (61.47±0.89)％]在G0/G1期的细胞数比率显著高于未处理组[(47.43±0.85)％]和对照siRNA组[ (48.43±0.73)％；F=271.653,P=0.000].进一步Boyden小室体外侵袭实验结果显示,KIAA0101 siRNA组(61.51 ±4.76)中MKN-45细胞穿过Matrigel的细胞数显著低于未处理组(138.74±10.16)和对照siRNA组(132.93±11.25；F=65.949,P=0.000).结论 KIAA0101表达下调能明显抑制胃癌细胞的增殖、诱导细胞周期静止和降低细胞的侵袭能力,因而有望成为胃癌治疗的新靶点.
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葡萄糖调节蛋白78对人结直肠癌RKO细胞增殖和迁移能力的影响
目的 探讨葡萄糖调节蛋白78(GRP78)对人结直肠癌RKO细胞增殖和迁移能力的影响.方法 构建编码GRP78的shRNA慢病毒表达载体pLV-shRNA GRP78及阴性对照慢病毒表达载体pLV-control,分别转染人结直肠癌细胞系RKO.四甲基偶氮唑盐法实验和克隆形成实验检测细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞周期的分布情况,划痕实验检测细胞迁移能力,裸鼠皮下成瘤实验检测细胞体内成瘤能力.Affymetrix人全基因组表达芯片检测GRP78表达抑制后RKO细胞中基因表达谱的变化.Western blot技术验证部分差异基因以确定结果的可靠性.结果 转染pLV-shRNAGRP78后,RKO细胞增殖能力及克隆形成数目明显受到抑制(P＜0.05),但迁移能力没有明显变化(P＞0.05);流式细胞术检测结果显示,沉默GRP78导致G1期细胞比例显著增加,而S期细胞比例显著降低(P＜0.05);裸鼠成瘤实验结果显示,沉默GRP78导致肿瘤细胞在裸鼠皮下成瘤能力显著减弱(P＜0.05).基因芯片检测结果显示,GRP78表达抑制后,共有397个基因的表达发生改变(与对照组相比,变化表达倍数≥1.2),其中上调的基因258个,下调139个,这些基因主要涉及信号转导、细胞代谢、细胞凋亡等功能.通过生物信息学分析,筛选3个(CDKN2B、MTOR及BIRC3)特异相关的差异基因进行Western blot验证,验证结果与芯片结果相符.结论 沉默GRP78可通过抑制人结直肠癌RKO细胞周期G1/S期转换,从而抑制细胞的体内外增殖生长能力,但对细胞的迁移能力无显著影响.通过基因芯片技术能够筛选和鉴定与GRP78表达改变相关的基因.GRP78可能通过调控这些基因的表达从而影响结直肠癌细胞的增殖能力.
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microRNA383调节人髓母细胞瘤Daoy细胞系中PRDX3的表达
目的 探讨microRNA383( miR-383)对人髓母细胞瘤Daoy细胞系中PRDX3基因的表达及细胞增殖活性与凋亡等的影响.方法 应用即时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测人髓母细胞瘤组织(15例)、Daoy细胞系、对照脑组织(5例)中miR-383及PRDX3mRNA表达水平；采用Western blot法检测人髓母细胞瘤组织、Daoy细胞系、对照脑组织中PRDX3基因蛋白表达水平；人工合成miR-383模拟体(mimics)转染人髓母细胞瘤Daoy细胞系,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法、流式细胞术等实验方法检测转染后各组Daoy细胞增殖与凋亡、细胞内活性氧水平、线粒体膜电位水平的变化.结果 15例人髓母细胞瘤组织中13例(13/15) miR-383表达水平较对照脑组织明显下调,14例( 14/15) PRDX3 mRNA表达水平较对照脑组织显著增高.miR-383、PRDX3mRNA在人髓母细胞瘤Daoy细胞系中表达水平分别为对照脑组织的0.353、1.315倍.PRDX3蛋白表达水平在人髓母细胞瘤组织、Daoy细胞系中较对照脑组织增高.miR-383mimics转染后24、48 h,实验组miR-383平均显著高于空白对照组,且48 h更加显著；而PRDX3mRNA、蛋白表达水平48 h较空白对照组显著降低.CCK-8法检测提示实验组中细胞增殖率较对照组明显降低(P＜0.05).Annexin VFITC法检测转染后48 h细胞凋亡结果显示miR-383 mimics实验组细胞早期凋亡率(11.60±0.30)％明显高于空白对照组(2.30±0.20)％(P=0.000).细胞内活性氧水平检测结果显示转染后24、48 h实验组较空白对照组细胞内活性氧水平明显升高,且48 h更加显著.线粒体膜电位水平检测结果显示转染后24h实验组线粒体膜电位水平较空白对照组明显降低.结论 与对照脑组织相比,miR-383在人髓母细胞瘤组织、Daoy细胞系中表达降低,PRDX3基因表达升高.上调miR-383可降低Daoy细胞系中PRDX3基因表达,并有效抑制Daoy细胞增殖活性,促进Daoy细胞凋亡,出现Daoy细胞内活性氧水平升高,线粒体膜电位水平降低的细胞功能学变化.
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BRD4在鳞状细胞癌中的表达及其对鳞状细胞癌细胞增殖和侵袭的影响
目的 探讨溴含蛋白质4(BRD4)在鳞状细胞癌(简称鳞癌)组织和细胞中的表达,并研究其表达下调对鳞癌细胞增殖和侵袭的影响.方法 采用免疫组织化学EnVision法检测食管鳞癌组织及正常食管鳞状上皮组织中BRD4蛋白的表达,Western blot检测不同鳞癌细胞和正常鳞状上皮细胞中BRD4蛋白的表达.将BRD4 siRNA和对照siRNA转染鳞癌Eca109细胞,实验分为3组:未处理组、对照siRNA组和BRD4 siRNA组,利用Western blot检测3组鳞癌Eca109细胞中BRD4蛋白的表达.利用CCK8检测3组细胞的增殖能力,采用Transwell小室检测3组细胞的侵袭能力,后采用Western blot检测3组细胞中基质金属蛋白酶(MMP)2和MMP9的表达.结果 BRD4蛋白在鳞癌组织中表达的阳性率显著高于正常鳞状上皮组织,4株鳞癌细胞中BRD4的表达均高于正常食管鳞状上皮细胞Het-1A.BRD4 siRNA能显著下调鳞癌Eca109细胞中BRD4蛋白的表达,其表达下调能显著抑制鳞癌Eca109细胞的增殖和侵袭能力(均P<0.05),并下调MMP2和MMP9的表达.结论 BRD4与鳞癌细胞的增殖和侵袭密切相关,因而可能成为鳞癌潜在的治疗靶点.
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lincRNA?ROR作为一个内源竞争RNA通过结合miR?145调节Oct4、Sox2和Nanog对结直肠癌干细胞生物学特性的影响及临床意义
目的 探讨长链非编码RNA(lincRNA)?ROR作为一个内源竞争RNA(ceRNA)结合miR?145对下游干性相关基因Oct4、Sox2和Nanog的表达,及对结直肠癌干细胞生物学特性的影响,并阐明这种分子调控网络的临床意义.方法 收集2014年至2016年间河南省南阳市中心医院及南阳市第二人民医院胃肠外科结直肠癌患者的癌组织及癌旁组织共52例,采用即时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测52例临床患者结直肠癌组织标本及结直肠癌细胞系中lincRNA?ROR、miR?145的表达;分析lincRNA?ROR和miR?145的表达与结直肠癌临床病理特征的相关性;流式细胞术从SW1116中分离CD44-CD133-和CD44+CD133+细胞;qPCR检测细胞中CD44、CD133、Oct4、Sox2、Nanog表达及CD44+CD133+细胞贴壁黏附后CD44、CD133、lincRNA?ROR、miR?145表达;生物信息学分析miR?145与lincRNA?ROR及核心转录因子Oct4、Sox2、Nanog之间靶向调控关系,双荧光素酶报告基因实验、qPCR、Western blot进行验证;噻唑蓝法、克隆形成检测沉默lincRNA?ROR对结直肠癌干细胞增殖及化疗敏感性的影响.结果 结直肠癌组织中lincRNA?ROR高表达,miR?145低表达,两者呈显著负相关(P<0.05);lincRNA?ROR表达与肿瘤大小、淋巴结转移、远端转移有关(P<0.05),miR?145表达与肿瘤大小、肿瘤位置有关(P<0.05);流式细胞术成功分选出 CD44+CD133+和 CD44-CD133-细胞, CD44+CD133+细胞中 CD44、CD133、Oct4、Sox2、Nanog、lincRNA?ROR 较 CD44-CD133-细胞高表达, miR?145低表达(P<0.05);贴壁黏附后CD44、CD133、lincRNA?ROR表达明显降低,miR?145表达增加(P<0.05);lincRNA?ROR能够结合miR?145调控Oct4、Sox2和Nanog表达;沉默lincRNA?ROR可显著抑制结直肠癌干细胞增殖克隆形成能力,增加其对顺铂、紫杉醇敏感性.结论 lincRNA?ROR结合miR?145调控核心转录因子Oct4、Sox2和Nanog表达来影响结直肠癌干细胞增殖及化疗敏感性,为后续研究结直肠癌发生发展中遗传网络组分之间相互作用的病理生理功能提供了新见解,为结直肠癌治疗提供新思路.
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Cas9稳定表达人肿瘤细胞株的建立及其基因编辑活性
目的：建立多种Cas9蛋白稳定表达的人肿瘤细胞株，验证细胞中Cas9的基因编辑活性，方便后续研究中目的基因的编辑。方法在15种来自不同组织的人肿瘤细胞株中通过慢病毒感染pLv-EF1α-Cas9-Flag-Neo或pLv-EF1α-Cas9-Flag-Puro及克隆筛选的方式建立Cas9稳定表达的细胞株；在其中3个细胞株中瞬时转入靶向TSC22基因的向导RNA，挑选单克隆，通过基因组PCR、测序及Western blot检测Cas9蛋白的基因编辑活性。结果筛选得到了69株Cas9稳定表达的人肿瘤细胞株，瞬时转入向导RNA后成功造成了细胞中TSC22基因的大片段缺失。结论成功建立了69株Cas9稳定表达的人肿瘤细胞株，其中的Cas9蛋白具有基因编辑活性。这些细胞株在大规模药物筛选、新药作用靶点的筛选以及基因功能研究等方面有潜在应用价值。
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乳腺癌发生模型MCF10 抑癌基因NOEY2启动子区甲基化及mRNA表达
DNA甲基化是常见的表观遗传学变化[1].越来越多的证据表明,抑癌基因启动子区CpG岛甲基化可使其转录沉默,从而解除其抑癌作用,导致肿瘤的发生和发展.NOEY2是近年来发现的抑癌基因,表达于正常乳腺导管上皮细胞和卵巢生发上皮细胞,但在乳腺癌和卵巢癌细胞中表达显著减少或不表达[2, 3].在本实验中检测乳腺癌发生模型MCF10[4]中不同阶段的细胞系NOEY2基因启动子区CpG岛Ⅰ甲基化状态,并与mRNA表达水平进行比较,以研究乳腺癌的发生机制和早期诊断.
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NDRG1基因在结直肠癌发生发展过程中的表达及其与淋巴结转移的关系
NDRG1基因(N-myc downstream regulated gene 1)是1997年由van Belzen等[1]用差异显示法从结肠癌细胞系HT-29中首先发现和分离的.Guan等[2]在8个结肠癌细胞系和10个结肠癌组织样本中研究了该基因与肿瘤转移的关系,提出该基因可作为一个候选的肿瘤转移抑制基因.我们采用免疫组织化学、原位杂交技术,观察NDRG1基因在结直肠癌发生发展过程中的表达特点,探讨其与结直肠癌转移的关系.
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Kail/CD82在转移能力不同结直肠癌细胞系的表达
Kail基因是Dong等[1]于1995年从人的第11号染色体分离出的基因,其编码产物为细胞膜糖蛋白CD82,由267个氨基酸组成,属于TM4SF(transmembrane 4 superfamily)或称TST(tetra spans transmembrane)家族成员.近些年的研究认为其与多种肿瘤的转移有关,如前列腺癌、肺癌、胰腺癌等.为了进一步明确Kail/CD82与结直肠癌转移的关系,我们选用人结直肠腺癌的4种细胞系LoVo、HCT116、HT29和SW480,分别观察Kail/CD82的表达情况,分析其与转移潜能的相关性.
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c-erbB-2在肾细胞癌组织及细胞系中的表达
一、材料和方法1.材料:选取1993～2000年在我院行根治性肾癌切除术的77例患者.平均年龄53±11岁(2 8～75岁).男性52例,女性25例.术后标本经甲醛固定和石蜡包埋,选取包含有肿瘤和正常组织的蜡块.细胞系有我院免疫室建立的人肾癌细胞系RCC-MZHQ、RCC-SKH、RCC-LSL 、R CC-SUL、RCC-WCS、 RCC-FTL和1个原代肿瘤细胞RCC-ZhXW.人肾癌细胞系RCC-Krause 、 RCC-Rupp-II为康奈尔大学惠赠.
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细胞周期蛋白依赖性激酶CDC2在不同级别胶质瘤和瘤细胞系中的表达
细胞周期蛋白依赖性激酶CDC2属于ser/thr蛋白激酶家族,在细胞周期G2至M期起关卡作用,无论是细胞进入还是走出增殖周期都与它的表达有关.文献报道,CDC2过度表达可使细胞周期进程紊乱,导致许多组织形成肿瘤.我们应用组织芯片和免疫组织化学技术检测了CDC2在人脑胶质瘤组织及其相关起源细胞中的表达,以探讨CDC2的表达与胶质瘤发生、发展的关系.
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诺帝对恶性胶质瘤细胞株U87MG生物学行为的影响及差异表达蛋白质组分析
目的 观察诺帝对人恶性胶质母细胞瘤细胞株U87MG及其移植瘤生物学行为的影响,分析和鉴定诺帝诱导U87MG细胞分化时高表达的差异蛋白质.方法 采用自行研制的化合物诺帝(纯度为99.87%)诱导U87MG细胞分化,再用U87MG细胞原位移植瘤模型裸鼠腹腔注射诺帝,观察肿瘤生长情况和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达改变.应用蛋白质双向电泳和PDQuest7.1软件对比分析诺帝诱导分化前后表达的差异蛋白质,采用基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱进行鉴定并分析其功能.结果 诺帝能显著抑制U87MG细胞体外增殖和原位移植瘤的生长(P＜0.01)并诱导其分化,U87MG细胞体外分化后高表达的差异蛋白质包括增殖相关基因A、交替拼接因子3、真核转录启动因子5A、丝切蛋白1、β半乳糖苷酶结合凝集素、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、α烯醇化酶和一种未知蛋白.结论 诺帝对人胶质母细胞瘤细胞株U87MG具有诱导分化的作用,其过程涉及多种蛋白质的表达改变,其中大部分蛋白质表达下调,这些蛋白质参与细胞增殖、代谢、分化、凋亡及基因转录的调控.
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SH-SY5Y神经细胞中α3神经型尼古丁受体对细胞凋亡及p38MAPK信号通路的影响
目的 研究人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中α3神经型尼古丁受体(nAChR)对细胞凋亡及凋亡相关信号通路p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的影响,了解α3 nAChR在老年性痴呆发病中的作用机制.方法 将细胞分为稳定转染α3 nAChR siRNA表达质粒组、空质粒组及正常对照组,用real-time PCR和Western blot法检测α3 nAChR mRNA水平和蛋白水平的表达,以评价RNA的干扰效率；real-time PCR方法检测凋亡相关蛋白bax及bcl-2 mRNA水平.将3组细胞用10 μmoL/Lβ淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)处理48 h,进一步用流式细胞术检测细胞凋亡率；用Western blot迹方法检测细胞中p-p38及p38蛋白表达水平的变化.将3组细胞用p38通路阻断剂阻断信号转导后再用Aβ25-35处理,测定细胞凋亡率.结果 稳定转染α3 nAChR siRNA表达质粒的细胞克隆株,α3 nAChR mRNA及蛋白表达水平分别降低了95％和86％；与空质粒和正常对照组相比,凋亡相关蛋白bax mRNA水平增加2.11倍(P＜0.01),bcl-2 mRNA水平下降0.53倍(P＜0.01),凋亡率未发生变化(3.40％±0.20％),但能增加Aβ诱导的细胞凋亡(24.52％±1.59％)；与Aβ处理SH-SY5Y细胞组相比,Aβ引起α3 nAChR沉默细胞p-p38蛋白表达水平增加178％ (P ＜0.01)；在加入p38特异性阻断剂后加入Aβ,与未加阻断剂时相比,3组细胞凋亡率均减少(p＜0.01),其中α3 nAChR沉默细胞组明显.结论 α3 nAChR沉默可能通过增强凋亡相关信号通路p38MAPK从而增加Aβ25-35的致凋亡作用；α3 nAChR沉默可以通过增加促凋亡相关蛋白bax,减少抗凋亡相关蛋白bcl-2从而增加Aβ25-35的致凋亡作用.
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乳腺癌发生模型MCF10各细胞系中WT1基因启动子区甲基化及mRNA表达研究
目的 通过观察乳腺癌发生模型MCF10中WT1基因启动子区甲基化状态和mRNA表达水平,探讨该基因在乳腺癌发生中的作用.方法 应用甲基化特异性PCR及双亚硫酸钠基因测序技术检测MCF10模型的乳腺增生细胞系MCF10A、癌前细胞系MCF10AT、导管内癌细胞系MCF10DCIS.com、浸润癌细胞系(MCF10CA1a、MCF10CA1d、MCF10CA1h)、经典乳腺癌细胞系MCF7及正常乳腺组织中WT1基因启动子区甲基化状态,然后用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和即时定量PCR技术检测上述样品的mRNA表达水平.结果 在MCF10模型的增生细胞系MCF10A、癌前细胞系MCF10AT、导管内癌细胞系MCF10DCIS.com、浸润癌细胞系(MCF10CA1a、MCF10CA1d、MCFI0CA1h)、经典乳腺癌细胞系MCF7中,WT1基因启动子均处于高度甲基化状态.与正常乳腺组织相比,WT1基因mRNA在MCF10模型的增生细胞系、癌前细胞系、导管内癌细胞系、浸润癌细胞系和经典乳腺癌细胞系MCF7中的表达均有不同程度的增加(MCF10A、MCF10AT、MCF10CA1a、MCF10CA1d、MCF10CA1h、MCF10DCIS、MCF7的WT1基因mRNA表达量分别是正常乳腺组织3.23、1.94、4.20、1.53、4.20、4.35、28.69倍).结论 乳腺癌发生过程中WT1 mRNA的表达不被启动子甲基化所抑制;WT1mRNA过表达出现于乳腺癌发生的早期阶段,提示该基因在乳腺癌发生中起作用.
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α7神经型尼古丁受体的神经保护作用及其与阿尔茨海默病发病的关系
目的 探讨α7神经型尼古丁受体(nAChR)表达改变与淀粉样蛋白前体蛋白(APP)代谢、细胞存活率及脂质过氧化水平的关系,以了解α7 nAChR的神经保护作用,以及该受体水平与阿尔茨海默病发病的关系.方法 设计并合成α7 nAChR基因特异性小分子干扰RNA(siRNA),转染SH-SY5Y细胞;用20μmoL/L DMXB处理细胞;培养48 h后收集细胞,分别应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测转染细胞及DMXB处理后的细胞αnAChR mRNA及蛋白表达水平的变化;并用1μmol/L β-淀粉样肽25-35(Aβ25-35)处理细胞,测定分泌型APP、总APP蛋白表达的变化;比色法测定脂质过氧化产物含量;MTT方法测定细胞活力.结果 转染siRNA后,与对照组相比,α7 nAChR mRNA及蛋白表达量降低(抑制率分别为80%和69%)、脂质过氧化产物丙二醛含量明显增加、分泌型APP表达下降、细胞活力明显低于对照组,且能增强Aβ的细胞毒性作用;用DMXB处理细胞后能使α7nAChR的表达增加23%、增加分泌型APP的表达、并能对抗A13引起的细胞活力下降及脂质过氧化水平的增强.结论 α7nAChR可能通过增强α-分泌酶对APP的切割、增强细胞抗氧化能力及对抗AB的神经毒性作用来发挥神经保护作用,其表达减少与阿尔茨海默病的发病机制有密切的关系.
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体外转染KISS-1基因对食管鳞癌细胞EC-1侵袭及增殖能力的影响
目的 观察KISS-1基因对食管鳞癌细胞EC-1侵袭及增殖能力的影响,探讨KISS-1基因与食管鳞癌生物学行为的关系.方法 检测KISS-1在EC-1、Eca109、EC9706和TE-1四种食管癌细胞株中的表达;利用脂质体介导在体外将KISS-1基因转染人食管鳞癌细胞EC-1,利用Western blot和RT-PCR方法检测转染之后KISS-1表达的改变,并采用Boyden小室体外侵袭实验及MTT、软琼脂克隆形成实验,观察KISS-1对食管鳞癌细胞侵袭及增殖能力的影响.结果 4种食管癌细胞株的Western blot和RT-PCR检测结果显示:EC-1中KISS-1蛋白(0.715±0.109)及mRNA(0.670±0.176)表达均低;转染之后Western blot和RT-PCR结果显示:KISSS-1蛋白和mRNA在转基因组的表达分别为1.143±0.218和0.877±0.162,均显著高于转空质粒组(0.745±0.130,0.685±0.128;t=3.850,2.481,P均<0.05)和对照组EC-1细胞(0.855±0.184,0.677±0.138;t=2.275,2.306,P均<0.05);Boyden小室检测细胞体外侵袭力实验发现转基因组在培养24、48和72 h后的穿膜细胞数分别为91.8±11.7,117.8±11.1和139.2±11.8,均显著低于转空质粒组(118.1±14.7,141.7±13.2,162.2±22.7;t=3.153,4.215,3.569,P值均<0.01)和对照组EC-1细胞(112.2±15.6,138.1±13.0,162.3±14.0;t=4.154,3.797,2.702,P值均<0.05).MTT检测结果显示,转基因组细胞在培养48 h和72 h后的增殖能力分别为0.517±0.127和0.394±0.137,与转空质粒组(0.636±0.186,0.513±0.150;t=2.054,2.709,P值均<0.05)和对照组(0.646±0.135,0.511±0.153;t=2.276,2.205,P值均<0.05)相比,细胞生长受到明显抑制;克隆形成实验结果显示,转基因组细胞的克隆形成数为157.2±36.4,明显低于转空质粒组(236.3±78.1;t=3.441,P<0.01)和对照组(242.5±48.6;t=2.250,P<0.05).结论 KISS-1基因在食管癌细胞株EC-1中可抑制细胞的体外侵袭能力及细胞的增殖能力.
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肿瘤转移抑制相关基因TMSG-1核仁定位信号序列的鉴定
目的 鉴定肿瘤转移抑制相关基因TMSG-1蛋白中潜在的特异性定位信号序列并探索其亚细胞定位机制.方法 聚合酶链反应(PCR)扩增TMSG-1开放读码框全长及不同长度的截断片段,定向克隆于绿色荧光蛋白(GFP)表达质粒pEGFP-N1;各融合蛋白表达质粒转染人胚肾细胞系HEK293细胞；转染48 h后提取细胞总蛋白进行GFP的Western blot检测或用冷丙酮固定细胞后激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位.结果 GFP分别融合TMSG-1全长蛋白(aa1-380)及其截断片段T1(aa1-70)、T2(aa1-128)、T3(aa129-380)、T4(aa71-128)、T5(aa71-179)和T6(aa71-380),Western blot检测结果显示成功表达了各融合蛋白.激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位显示融合蛋白T4(aa71-128)主要定位于细胞核内的核仁部位,融合蛋白T6(aa71-380)以细胞核内弥散分布为主,而TMSG-1全长融合蛋白及融合蛋白T1、T2、T3、T5则定位于胞质.进一步的序列缺失去除T4( aa71-128)羧基末端10个氨基酸得到截断片段T4Δ119-128,T4Δ119-128融合的GFP仍位于细胞核,但核仁内的绿色荧光信号明显减弱.结论 肿瘤转移抑制相关基因TMSG-1存在潜在的核仁定位信号,位于aa119-128(RRRRNQDRPS),这一发现为深入研究TMSG-1的亚细胞定位及相关功能奠定了基础.
