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转录因子PAX5在儿童急性白血病细胞中的表达
为了观察了解儿童急性白血病细胞中转录因子PAX5的表达特性,采用实时定量RT-PCR方法测定了6个血液肿瘤细胞株以及6例正常儿童、58例初发和4例复发急性白血病儿童(其中包括39例B-ALL,10例T-ALL和13例AML)骨髓细胞中PAX5和CD19 mRNA的表达水平.结果表明:在Namalwa(B细胞系)细胞株中,PAX5和CD19 mRNA相对表达量分别为2.35%和2.52%;而在T-和髓系细胞株中几乎不表达.在临床样本中B-ALL组比T-ALL组和AML组的PAX5 mRNA表达高(P=0.029和P=0.013).T-ALL组和AML组的PAX5mRNA表达水平均低于正常对照组,而T-ALL组与AML组之间的表达差异无显著意义.在B-ALL患儿中,PAX5 mRNA表达的个体差异很大.此外还发现,初发治疗前组和复发组的B-ALL患儿PAX5 mRNA表达高于化疗完全缓解组(P=0.011和P=0.006).由于在CD19基因的启动子上有B细胞特异性激活蛋白的结合位点,研究发现在B-ALL中PAX5表达水平与同样用实时定量RT-PCR检测的CD19表达水平之间存在明显的相关性.结论:运用实时定量RT-PCR方法能快速准确地在B-ALL的临床标本中检测和定量PAX5基因的表达.研究中发现部分B-ALL中PAX5 mRNA表达明显升高,因此它可将其作为进一步研究B-ALL发病机理的另一个切入点.
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抑癌基因WWOX在肝外胆管癌中的表达
目的:检测WWOX mRNA及其编码蛋白在肝外胆管癌中的表达,分析其临床病理学意义.方法:用Real Time RT-PCR方法定量分析21例胆管癌组织WWOX mRNA表达情况,5例肝移植的正常胆管组织作为对照;采用UIP法染色检测相应病理切片的蛋白表达情况,并比较mRNA和蛋白在不同分级组织中的表达差异.结果:WWOX mRNA在肝外胆管癌中的表达显著低于正常胆管组织(8.936×10-7±3.253×10-7 vs 1.079×10-6±1.735×10-7,P＜0.001),47%表达缺失;蛋白表达的缺失频率为57%,其mRNA及蛋白表达与组织学分级有显著相关(r=-0.583,-0.840,P＜0.001),而年龄、性别、术前肝功能及临床分期无显著相关性.低分化胆管癌组织中的表达显著低于分化较好的肿瘤组织(P＜0.05).结论:WWOX表达改变参与胆管癌的发病,可作为预测肝外胆管癌生物侵袭性的有效指标.
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实时RT-PCR检测甲型H3N2流感病毒R292K耐药位点
目的 建立快速检测甲型H3N2流感病毒神经氨酸酶(NA)奥司他韦耐药突变位点的实时RT-PCR方法.方法 通过设计特异性靶向NAR292K突变位点的Taq-MGB探针进行实时RT-PCR反应,并利用模拟样本和临床标本进行灵敏性和特异性评价.结果 与结论建立了快速检测NAR292K位点的实时RT-PCR检测方法;本方法灵敏性高,可检测低至500拷贝/μl;特异性好,与无耐药突变的甲型H3N2流感病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,为流感耐药监测提供了有效工具.
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肝动脉化疗栓塞对肝癌患者外周血AFP mRNA表达水平的影响
目的探讨肝动脉化疗栓塞对肝癌患者对外周血AFP mRNA表达水平的影响.方法采用实时RT-PCR技术,定量检测24例肝细胞癌患者肝动脉化疗栓塞前后外周血AFP mRNA的表达水平.结果肝癌患者肝动脉化疗栓塞前外周血AFP mRNA平均表达水平为(133 074.6±27 163.7)拷贝/μgRNA,肝动脉化疗栓塞后24 h、1月、2月平均表达水平分别为(2076.0±423.8)、(1774.5±362.2)和(23 650.4±4827.6)拷贝/μgRNA.结论肝动脉化疗栓塞可显著降低肝癌患者外周血AFPmRNA表达水平,AFPmRNA可作为评估肝动脉化疗栓塞效果的一个重要指标.
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生物材料生物相容性的分子生物学研究进展
随着分子生物学的迅速发展,生物材料生物相容性研究手段逐渐多样化,其评价已从整体、细胞水平进入了分子水平,本文将对生物材料的分子生物相容性研究的现状进行回顾和展望.
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手足口病病原构成动态变化与重症病例时间分布:定点医院近4年观察
目的 探讨手足口病病原构成动态变化监测对预估重症流行强度的意义.方法 回顾性描述2008-5-13 ～ 2011-12-31 门急诊及住院手足口病例粪便或肛拭取材中病原核酸实时RT-PCR 检测结果.按周分别计数肠道病毒71 型(EV71)、柯萨奇病毒A 组16 型(Cox A16)及非EV71 非Cox A16 肠道病毒(以下简称"其它肠道病毒")感染病例总数及重症病例数,对时间作图.结果 手足口病各类病原构成处在动态变化之中.近4 年监测到显著的两个重症发病高峰发生在2008 年5 ～ 7 月以及2010 年3 ～ 7 月,这两个时间段均处在每年手足口病流行高峰时段,优势病原均是E V71.重症发病少的时间段为2008 年9 月～ 2009 全年,优势病原为其它肠道病毒和Cox A16.各类病原感染者重症风险值高低排序为EV71、其它肠道病毒、Cox A16.结论 手足口病病原构成动态变化监测可以随时掌握当前及未来短期内病原相对活动度,根据病原各自重症风险值高低,就可以在手足口病流行高峰期前预估重症流行强度.
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三门峡地区2009-2014年手足口病病原学检测分析
目的 对2009-2014年三门峡地区临床诊断手足口病病例进行病原学检测,为该病的预防和临床诊断治疗提供可靠依据.方法 运用实时RT-PCR技术检测样本中的肠道病毒PE、肠道病毒EV 71型、柯萨奇病毒A16型,并结合流行病学资料予以分析.结果 855份临床诊断手足口病病例样本检出阳性686份,阳性率为80.23％.其中肠道病毒EV 71型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒PE型分别占阳性样本的45.19％、30.32％、24.49％,差异有统计学意义(x2 =70.34,P＜0.05).时间分布上病例高发期主要在4～7月份,年龄主要在3岁以下,男女阳性率分别为70.96％和80.65％,地区分布上各县区阳性检出率差异有统计学意义.结论 三门峡市发生的手足口病以EV 71和Cox A16型病毒为主,不同年份流行优势株有所差别,其他肠道病毒的比例显著增加,因此加强手足口病病毒的分型检测至关重要.
关键词： 手足口病 肠道病毒EV 71型 柯萨奇病毒A16型 实时RT-PCR -
新疆伊犁地区马脑组织西尼罗病毒感染的调查
目的 了解新疆伊犁地区草原放养马群中西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)中枢感染的流行状况.方法 采用一步法实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real Time RT-PCR)对采自新疆伊犁地区草原放养、未接种WNV疫苗的189例马脑组织进行WNV包膜蛋白(E)基因片段检测.结果被检马脑组织标本中未发现WNV E基因片段.结论 目前尚没有证据表明我国新疆伊犁地区的放养马中存在WNV脑炎的感染,提示该地区出现WNV脑炎流行的可能性小.
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强直性脊柱炎和类风湿关节炎患者外周血单个核细胞中Toll样受体4基因的表达及临床意义
目的 探讨Toll样受体4(TLR4)mRNA在强直性脊柱炎(AS)、类风湿关节炎(RA)患者以及健康个体外周血单个核细胞(PBMC)中的表达差异及其临床意义.方法 应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测2006年3月至10月第二军医大学附属长征医院60例AS患者、20例RA患者及30例健康对照PBMC中TLR4 mRNA的表达水平;应用ESR自动化分析仪和特定蛋白电泳仪分别测定红细胞沉降率(ESR)和血浆C反应蛋白(CRP).结果 AS和RA患者PBMC TLR4 mRNA的表达水平明显高于对照组,但两疾病组之间差异并无显著性意义;人类白细胞抗原(HLA-B27)阳性和阴性AS患者均显著高于健康对照组,且HLA-B27阳性AS患者显著高于RA组,但两组AS患者以及HLA-B27阴性AS与RA患者之间,TLR4 mRNA差异无显著性意义;在HLA-B27阳性AS患者中,TLR4 mRNA的表达与ESR及CRP呈显著相关性,但在HIA-B27阴性AS患者中则无这种相关性.在RA患者中,TLR4 mRNA与CRP呈显著相关性.结论 AS和RA患者PBMC TLR4 mRNA的表达均上调,AS患者上调与HLA-B27阳性与否无关,但HLA-B27阳性AS患者比RA上调更明显,且HLA-B27抗原影响AS患者TLR4 mRNA与ESR及CRP的相关性.TLR4,的异常表达可能在AS和RA的发生和发展中起作用.
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SYBR Green Ⅰ实时RT-PCR定量检测前列腺癌患者外周血DD3mRNA
目的 建立一种新的方法定量检测前列腺癌(PC)患者外周血DD3mRNA方法扩增LNCaP细胞株阳性表达的DD3mRNA,并以其扩增产物为外标准,通过优选引物及优化PCR的各项参数,建立了SYBR Green实时RT-PCR定量检测PC患者外周血DD3 mRNA的方法,并以此方法检测了健康男性志愿者、良性前列腺炎(BPH)患者和PC患者外周血DD3 mRNA.结果 所建立的SYBR Green实时RT-PCR方法少可检测到10拷贝的核酸,在每反应108-103copies/ml范围内,CT值与起始模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为-0.992～-1;扩增后仅有的熔解曲线特异峰显示很好的特异性;不同标准点批间变异系数范围为6.1%-13.7%(n=5).结论 基于双链嵌合染料SYBR Green建立的RT-PCR定量检测DD3 mRNA方法具有敏感性高、线性检测范围广、特异性强、重复性较好的特点;PC患者外周血中可检测到DD3 mRNA表达.
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前列腺增生和前列腺癌患者组织前列腺特异性抗原mRNA水平
目的 探讨外周血前列腺特异性抗原(PSA)水平和良恶性疾病前列腺组织生成PSA能力的关系.方法 应用实时荧光定量(RT-PCR)技术测定前列腺癌(PCa)、前列腺增生(BPH)伴炎症和不伴炎症患者前列腺组织中的PSA mRNA含量.PSA定量检测采用电化学发光法.结果 血PSA浓度在BPH组和PCa组比较差异显著(P＜0.01),组织PSA mRNA表达量在BPH组和PCa组比较无显著性差异(P＞0.05).PCa组组织PSA mRNA表达量与外周血PSA值无相关性.结论 PCa患者血PSA水平与PSA生成能力无相关性,PCa分化差者PSA生成能力显著降低.
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生存素检测在膀胱癌实验诊断中的意义
目的:检测膀胱癌患者血液和尿液细胞中生存素(survivin)基因的表达并评价其临床意义.方法:取40例膀胱移行细胞癌患者(TCC组)、19例其他泌尿系统疾病患者(对照组)和20名健康成人(正常人组)的外周血和新鲜尿液,以实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测外周血有核细胞及尿液脱落细胞中生存素基因的表达,并检测甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的表达作为对照.结果:TCC组患者外周血生存素25例阳性(62.5%),对照组和正常人组均为阴性;尿脱落细胞检测结果示TCC组28例阳性(70.0%),对照组仅2例阳性(10.5%),而正常人组均为阴性.TCC组阳性率与其他2组差异有显著性(P＜0.01),而在不同病理分级的TCC患者的阳性率无统计学差异(P＞0.05).合并分析血液和尿液中的生存素检测结果对TCC的总检出率达87.5%,对TCC组Ⅱ级和Ⅲ级的检出率(96.6%)显著高于Ⅰ级(63.6%)(P＜0.05).结论:生存素基因在膀胱癌患者血液和尿液细胞中重新表达,运用实时RT-PCR法测定血液和尿液细胞中生存素表达具有较好的肿瘤特异性,可作为一种新的检测膀胱癌的无创性方法.
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胸腺嘧啶磷酸化酶在结直肠癌组织中的表达
目的研究胸腺嘧啶磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TP)在结直肠癌组织中的表达,为临床用药提供指导.方法运用实时荧光定量RT-PCR和ELISA方法分别从mRNA和蛋白质水平对TP在结直肠癌组织及相邻正常组织中的表达进行检测.结果无论是在mRNA还是蛋白质水平,肿瘤组织中的TP表达高于其相邻正常组织,肿瘤组织中的TP蛋白水平为7.82±4.31 ng/μgTPO,mRNA水平为1.66±0.766;正常组织中TP蛋白水平为5.03±2.48 ng/μgTPO,mRNA水平为1.05±0.60;并且ELISA结果与实时RT-PCR结果具有一定的相关性(γ=0.81).结论胸腺嘧啶磷酸化酶在结直肠肿瘤中的表达对于临床使用5-FU类药物具有指导意义.
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急性白血病细胞端粒结合蛋白2表达的研究
目的:研究人类白血病细胞株及原代白血病细胞中人端粒结合蛋白2(TRF2)的表达.方法:应用实时定量RT-PCR,检测白血病细胞株及原代白血病细胞中TRF2 mRNA的表达,应用Western Blot,检测TRF2蛋白的表达.结果:T淋巴系白血病细胞株的TRF2表达显著高于骨髓单个核细胞和髓系白血病细胞株.在原代白血病细胞中,M0和M1亚型患者白血病细胞TRF2的表达高于其他各亚型急性髓系白血病(AML)患者.结论:预后差的AML患者和T细胞恶性肿瘤细胞株高表达TRF2,提示TRF2高表达可能和白血病的预后有关.
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实时RT-PCR法检测感染小鼠不同组织标本中的委内瑞拉马脑炎病毒
目的 为委内瑞拉马脑炎病毒所致疾病的早期诊断和流行病学研究提供技术支持.方法 建立了委内瑞拉马脑炎病毒特异、敏感和快速的实时RT-PCR法,并对委内瑞拉马脑炎病毒感染昆明小鼠的不同组织标本中的病毒载量进行了定量检测.结果 本研究建立的实时RT-PCR法敏感(10TCID50/ml)、特异(对其它甲病毒成员,如东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒检测为阴性).该方法可从委内瑞拉马脑炎病毒感染小鼠后第1d的血液、脾脏、脑组织中检测到不同含量的病毒核酸,而在感染后第3d仅从脾脏和脑组织中检测到病毒核酸.结论 实时RT-PCR法不仅是一种敏感、准确的检测方法,可用来了解病毒感染量与疾病严重程度的关系和评价病毒病疫苗的免疫效果,而且也为VEEV疾病的临床诊断和流行病学监测提供工具.
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转移性腺样囊性癌细胞纤连蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白多糖mRNA的表达
目的:比较纤连蛋白(FN)和硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)mRNA在高转移腺样囊性癌细胞系ACCM和低转移细胞系ACC2的表达,探讨其与腺样囊性癌转移的关系.方法:获取培养第2、4、6、8天的ACC2和ACCM mRNA样本,合成cDNA,用实时RT-PCR测定FN和HSPG的量.结果:培养第2、4、6、8天ACCM FNmRNA的值为0.14、0.25、1.50、1.65,而ACC2的值为0.03、0.06、0.09、0.18.HSPGmRNA在ACCM第2、4、6、8天的值分别为0.35、0.32、0.41、0.65,而ACC2为0.07、0.10、0.29、0.75.ACCM细胞的FN和HSPG mRNA表达明显高于ACC2.结论:ACCM的FN和HSPG mRNA高表达与肿瘤转移表型关系密切.
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VEGF165b和VEGF165在胃癌组织中的表达及与预后的关系
目的 研究VEGF165b和VEGF165在胃癌及癌旁正常组织中的表达及胃癌组织中VEGF165bmRNA/VEGF165 mRNA与预后的关系.方法 分别应用实时RT-PCR和免疫组织化学法检测胃癌及癌旁正常组织中VEGF165b和VEGF165的基因及蛋白表达,并对患者进行2年的随访,比较VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA比值及这两种蛋白表达水平在胃癌及癌旁组织中的变化;同时分析VEGF165b与VEGF165蛋白表达的相关性以及胃癌组织中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA与预后的关系.结果 在胃癌组织中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA低于癌旁正常组织中的水平;在癌旁正常组织中VEGF165b基因及蛋白表达强于VEGF165,在胃癌组织中VEGF165b基因及蛋白的表达则低于VEGF165,而且两者表达呈负相关关系;此外,在两年内死亡的患者中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA明显低于生存患者中的比值水平.结论 与正常组织相比,胃癌组织中存在VEGF165b向VEGF165基因及蛋白水平上的优势转换,这种变化有望成为治疗胃癌的新靶点.
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人3型腺病毒荧光定量PCR检测方法的建立
目的 通过建立人3型腺病毒荧光定量PCR检测方法,快速鉴定人3型腺病毒感染,为早期诊断提供依据.方法 以人3型腺病毒感染的细胞和常见的呼吸道消化道感染的病原体为研究对象,根据病毒六邻体高度保守的序列,设计荧光定量PCR反应体系,并分析实验的敏感性和特异性.结果 人3型腺病毒TCID_(50)细胞培养液中病毒核酸低检出稀释度是10~(-6),对应的拷贝数分别是5.802x10~3 copies/mL和6.968x10~2copies/mL,呼吸道和消化道感染常见的病原体未出现交叉反应.结论 荧光定量PCR的应用,可有效缩短检测时间,提高检测的敏感度.
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广州地区白纹伊蚊体内登革病毒的检测
目的 了解广州地区登革热传播媒介白纹伊蚊携带登革病毒的情况,为登革热预防控制提供预测预警信息.方法 从广州11个行政区及其登革热旧疫点捕获白纹伊蚊成蚊和幼虫(经实验室培育羽化成成蚊),提取登革病毒RNA.One step SYBR Green Ⅰ实时RT-PCR进行检测.结果 2005-2007年从广州地区采集的493批白纹伊蚊(6 255只)中,共检测出两份阳性结果 ,分别来自登革热疫点和旧疫点,经测序证实为登革Ⅰ型,其余为阴性.低感染率为0.32.结论 本文白纹伊蚊携带登革病毒比率较低,可能与登革病毒在蚊体内传代的递减效应、采样时间滞后以及广州登革热非连续性爆发有关.
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实时RT-PCR基因表达相对定量REST(C)软件分析与2(-△△CT)法比较
目的 利用实时RT-PCR技术建立一种简便、准确的基因表达相对定量方法.方法 以正常的人支气管上皮细胞株(16HBE)cDNA为模板5倍系列稀释,分别作DNA聚合酶K(POLK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因标准曲线.以不同剂量反式二羟环氧笨并芘(anti-BPDE)诱导的16HBE、anti-BPDE转化的16HBE及肺癌细胞株(H1299)cDNA为模板,进行实时定量RT-PCR.以GAPDH基因作为内参照.进行POLK基因表达相对定量.实验数据分别采用2(-△△CT)法及REST(C)软件分析.结果 5倍系列稀释法制作的标准曲线,呈现较好的线型关系(Rsq 0.997).POLK及GAPDH基因扩增效率分别为117.5%和103.5%.采用2(-△△CT)法计算出的表达比值均比REST(C)软件分析高.结论 实时RT-PCR技术结合REST(C)软件分析是一种简便、准确的基因表达相对定量分析手段.
