报告基因方法对壬基酚、双酚A雌激素样活性的体外研究

目的利用基于报告基因的MCF7细胞体外雌激素检测方法对壬基酚(NP)、双酚A(BPA)的雌激素样活性及作用机制进行研究.方法合成人雌激素反应元件(ERE)核心片断并将其插入pGL3-promoter载体的多克隆位点构建而成雌激素反应元件ERE调控的报告质粒pERE-Luc,用脂质体转染法将pERE-Luc及内对照质粒phRL-SV40瞬时转染MCF7细胞,用17β雌二醇(E2)、三苯氧胺(Tam)、壬基酚、双酚A等处理后检测报告基因荧光素酶的表达.结果转染pERE-Luc的MCF7细胞的报告基因表达与E2呈明显的剂量-反应关系,1×10-11mol/L E2可引起报告基因的表达,至1×10-9mol/L可达到大表达值,而未转染pERE-Luc时与E2无明显反应,三苯氧胺可以显著抑制E2引起的报告基因的表达.1×10-6mol/L以上NP和BPA出现雌激素样作用.NP的雌激素样活性略强于BPA.结论本试验建立并采用的基于报告基因的体外雌激素检测方法是可行的,NP和BPA有一定的雌激素样活性作用.

胶艾汤及参芪胶艾汤的雌激素样作用及可能机制

目的:观察胶艾汤及其加味方参芪胶艾汤的植物雌激素样作用,并利用雌激素受体(ER)(+)MCF7细胞探讨其发挥雌激素样作用的可能靶点和机制.方法:正常昆明种性未成熟雌性小鼠60只,体重9～12 g,按体重均衡和随机的原则分为6组:正常组给予等体积蒸馏水,阳性药己烯雌酚组按0.35 mg·kg~(-1)·d~(-1)给予己烯雌酚,胶艾汤和参芪胶艾汤低,高剂量组分别按2.5,5.0 g·kg~(-1)·d~(-1)给予中药方剂,给药持续4 d.第5天眼眶取血,分离血清,称取子宫并计算子宫系数.通过MTT细胞增殖实验观察2个方剂含药血清对MCF7细胞增殖的影响;运用实时荧光定量RT-PCR技术检测含药血清对雌激素效应基因pS_2及ERα，ERβ泶锏牡骺刈饔茫徊⒁源萍に厥芴遛卓辜罥CI182,780干预,探讨其发挥雌激素样作用的可能机制.结果:高剂量胶艾汤及参芪胶艾汤能够明显提高性未成熟小鼠的子宫系数(P<0.05);其含药血清能够显著促进MCF7细胞增殖(P<0.05或0.01),加入ER拮抗剂ICI182,780可抑制其促增殖作用(P<0.05或0.01).与已烯雌酚组一致,2个方剂含药血清也可提高靶细胞pS_2表达水平(P<0.01),加入ICI182,780可抑制ps_2表达水平的提高(P<0.01);2个方剂含药血清还可明显提高ERα(P<0.05)和ERβ(P<0.01)的表达水平.结论:胶艾汤及参芪胶艾汤均具有一定的通过ER介导的雌激素样作用,并可提高靶细胞ER亚型(特别是ERβ）mRNA的表达水平.

hR24L基因转染对MCF7细胞凋亡的影响

为研究人类DNA损伤修复基因hR24L与细胞凋亡的关系,首先用PCR方法扩增了hR24L基因的开放阅读框(ORF),成功地构建了正义和反义hR24L基因的逆转录病毒表达载体重组体.然后用这两种重组质粒转染MCF7细胞,筛选出的阳性克隆再分别用过氧化氢、丁酸钠和去血清饥饿诱导凋亡,用Northern印迹杂交分析hR24L基因表达情况,用流式细胞仪和电泳检测细胞凋亡.结果发现转染正义hR24L重组载体的细胞的hR24LmRNA表达水平升高,其凋亡面积所占比例(21.21±2.42)比对照细胞(46.16±4.38)明显降低;而转染反义hR24L重组载体的细胞的hR24LmRNA表达水平则下降,但其凋亡峰面积所占比例(31.05±3.02)比对照细胞也明显降低,表明两者均抑制过氧化氢和去血清饥饿诱导的凋亡,但它们对丁酸钠诱导的凋亡均无抑制作用.可见hR24L基因通过复杂的途径参与细胞凋亡的调控.

脂肪间充质干细胞源exosomes对乳腺癌细胞系MCF7中microRNA表达谱的影响

目的 观察脂肪间充质干细胞源exosomes的生物学特性,初步探讨其对乳腺癌细胞系MCF7中microRNAs表达谱的影响.方法 收集脂肪间充质干细胞培养上清液,以超滤和超离的方法提取exosomes;电镜下观察形态;用Western blot检测exosomes表面蛋白标志物的表达情况;用Dil染料标记exosomes后加入到乳腺癌细胞MCF7上清中,荧光显微镜下观察MCF7对exosomes的内吞作用;用microRNA芯片检测MCF7在exosomes处理24 h后microRNAs表达谱的变化以及exosomes中含有的microRNAs种类.结果 脂肪间充质干细胞分泌30 ～ 100 nm的exosomes,exosomes表达CD63和HSP70,可被乳腺癌细胞MCF7内吞;exosomes作用24 h,可引起MCF7中244个microRNAs表达发生变化(其中174个表达上调,70个表达下调,倍数＞2倍);对脂肪间充质干细胞exosomes中microRNAs的分析提示MCF7中microRNAs的上调大部分是内源性的,不是exosomes输入的.结论 脂肪间充质干细胞源exosomes可以诱导乳腺癌细胞MCF7micmRNA表达谱发生变化,揭示了间充质干细胞影响乳腺癌细胞发生和发展的一个新机制.

HER2/neu过表达通过PI3K/Akt通路对乳腺癌细胞MCF7中p53基因表达及细胞生长和放疗敏感性的影响

目的研究HER2/neu基因过表达通过磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)通路对乳腺癌细胞MCF7野生型p53基因表达、细胞增殖及对γ射线照射敏感性的影响.方法以脂质体介导的HER2/neu基因转染MCF7细胞,用G418筛选阳性克隆.通过Western blot鉴定HER2/neu蛋白的表达,并检测p53、信号转导分子Akt和p-Akt蛋白含量的变化及PI3K通路抑制剂LY294002对上述蛋白表达水平的影响.以MTT法检测细胞增殖以及细胞对γ射线照射的敏感性.结果共获得18个稳定转染HER2/neu基因的阳性克隆,其中1个克隆有HER2/neu基因过表达.过表达HER2/neu的MCF7细胞p-Akt蛋白含量升高,p53蛋白含量低于对照组细胞,LY294002能够抑制p-Akt蛋白和p53蛋白的变化.同时,过表达HER2/neu基因的MCF7细胞生长速度高于对照组细胞,对γ射线照射治疗的敏感性降低,而LY294002能够抑制细胞生长并增强放射治疗的敏感性.结论 MCF7细胞中HER2/neu基因的过表达,能够通过激活PI3K通路导致野生型p53蛋白含量减少、细胞增殖加快及放疗的敏感性降低,这可能是某些p53蛋白为野生型的肿瘤患者对治疗产生抗性的原因.

薯蓣次苷A通过下调STAT3及糖代谢相关基因表达抑制MCF7细胞生长

花姜酮对MCF7细胞的增殖和迁移与侵袭的影响及其作用机制研究

目的 研究花姜酮对乳腺癌MCF7细胞增殖、迁移及侵袭的影响及潜在分子机制.方法 以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测花姜酮对MCF7细胞增殖的影响;根据MTr结果,将实验分为4组:空白对照组和低、中、高3个剂量实验组.实验组分别给予5,10,20 μmol·L-1的花姜酮,空白对照组给予等体积的二甲基亚砜(DMSO),处理48 h.用划痕、Transwell和平板克隆实验测定花姜酮对MCF7细胞迁移、侵袭和克隆形成能力;以免疫印迹法检测相关蛋白表达情况.结果 与空白对照组相比,低、中、高剂量花姜酮处理48 h后,MCF7细胞的增殖能力分别降至(89.7±5.4)％,(82.0±6.9)％,(62.7±4.6)％,迁移能力分别降至为(72.7±5.7)％,(55.0±3.9)％,(32.7±4.6)％,侵袭能力降至(77.6±7.8)％,(49.1±4.7)％,(40.8±6.2)％,差异均有统计学意义(均P＜0.01).空白对照组的克隆形成率为(41.4±6.3)％,低、中、高3个剂量实验组依次降至(27.4±4.8)％,(20.4±5.1)％,(5.4±0.8)％,实验组与空白对照组比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).花姜酮处理MCF7细胞后,E-cadherin的表达量随低、中、高3个浓度而梯度上调,但N-cadherin的表达量随浓度而梯度下降,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 花姜酮能够抑制MCF7细胞的增殖、迁移和侵袭,机制可能与促进E-cadherin、抑制N-cadherin的表达有关.

补骨脂等5种中药植物雌激素活性的实验研究

目的 评价补骨脂等5种中药的植物雌激素活性及其可能机制.方法 正常Wistar雌性大鼠(刚断乳)96只,随机分为12组(溶剂对照组、己烯雌酚组、5个中药组和5个中药+己烯雌酚组).各组动物给药4 d后处死,计算动物子宫系数和体重增幅;取血并分离血清.利用雌激素受体(ER)阳性MCF7细胞,以MTT法检测含药血清对细胞增殖的影响;通过流式细胞术检测含药血清对细胞周期的影响.结果 ①灌胃补骨脂、川牛膝能明显增加大鼠的子宫系数(P＜0.05);灌胃补骨脂、川牛膝、红花可使己烯雌酚引起的大鼠子宫系数的升高受到显著抑制(P＜0.05);灌胃川牛膝可使大鼠的体重增幅明显上升(P＜0.05);②补骨脂、川牛膝、红花、丹参等中药组合药血清均可使MCF7细胞增殖加速(P＜0.01),加入ERB激动剂DPN可减弱其促增殖效应;在拮抗实验中,中药组含药血清对细胞增殖的促进作用较单独使用己烯雌酚的组别有明显下降,加入DPN可进一步增强其下降效应(P＜0.05或P＜0.01);③补骨脂、川牛膝、丹参、菟丝子等中药组合药血清均可提高细胞增殖指数;各中药+己烯雌酚组含药血清对己烯雌酚引起的细胞增殖指数的增加均无明显的拮抗作用.结论 补骨脂、川牛膝、红花、丹参、菟丝子等5种中药均具有一定的植物雌激素作用,但其作用强弱及途径有所差异.

槟榔碱对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察槟榔碱对人乳腺癌细胞(MCF-7)增殖和凋亡的影响,并探讨其机制.方法:采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度(0、10、30、50、100、300、500 μmol/L)槟榔碱对MCF-7细胞增殖的影响,Hoechst 33342染色和流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测Bax,Bcl-2和P53蛋白表达.结果:低浓度(0、10、30、50 μmol/L)槟榔碱不影响细胞的增殖和凋亡;而高浓度(100、300、500μmol/L)槟榔碱呈浓度依赖性抑制MCF-7细胞增殖、诱导MCF-7细胞凋亡、提高P53和Bax蛋白表达、降低Bcl-2蛋白表达.结论:高浓度槟榔碱抑制MCF-7细胞增殖、诱导凋亡,其机制可能与提高P53和Bax蛋白表达,降低Bcl-2蛋白表达有关.

PUMA基因在水飞蓟宾诱导乳腺癌细胞凋亡的作用

目的:探讨凋亡相关基因PUMA在体外水飞蓟宾(silybin,SIL)诱导乳腺癌MCF7细胞凋亡过程中的作用.方法:MCF7细胞分为二组:对照组和SIL组,SIL组处理浓度分别为10、20、40 mg/L,各组细胞分别培养24、48及72 h.MTT法检测SIL对乳腺癌MCF7杀伤率,TUNEL法(DNA断裂的原位末端标记法)测定各组细胞凋亡率,Caspase-Glo⑧3/7定量试剂盒测定细胞Caspase3/7的表达情况,Western blot法检测PUMA蛋白表达水平.结果:上述浓度下的SIL对MCF7细胞增殖均具有抑制作用(P<0.01),其中浓度为40mg/LSIL处理的MCF7细胞在72h时抑制效果明显,结果呈药物浓度及时间依赖效应;TUNEL法检测显示(48h) SIL可以显著增加MCF7细胞的凋亡率(P<0.01);Caspase3/7检测显示SIL可以使Caspase3/7活性显著升高(P<0.01);Western blot法检测显示SIL可以诱导PUMA蛋白的表达升高.结论:凋亡相关基因PUMA在水飞蓟宾诱导乳腺癌MCF7细胞凋亡过程中具有显著作用,诱导PUMA蛋白表达可能是水飞蓟宾抗癌作用的机制之一.

沉默GRP94基因对乳腺癌MCF7细胞增殖和凋亡的影响

目的：研究沉默葡萄糖调节蛋白GRP94（Glucose regulated protein，GRP94)对乳腺癌MCF7细胞增殖、凋亡的影响及潜在机制。方法：设计并化学合成靶向沉默GRP94基因的小干扰RNA，通过脂质体转染入MCF7细胞中，采用qRT-PCR和Western blot分别检测GRP94、cyclinD1、Bax和Bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平；通过流式细胞术检测细胞凋亡比例变化，Hoechst 33258染色检测凋亡细胞核变化、CCK8实验检测细胞增殖能力的变化。结果：GRP94 siRNA组GRP94基因的表达水平被有效抑制；与对照组相比，GRP94-siRNA转染组的细胞凋亡比例明显增加；凋亡细胞核形态发生变化；增殖能力明显下降；mRNA及蛋白水平cyclinD1、Bcl-2表达明显下调，Bax表达增加。结论：沉默GRP94基因可明显抑制乳腺癌MCF7细胞增殖能力，促进细胞凋亡的发生，且其可能通过下调cyclinD1、Bcl-2和上调Bax表达参与其中。

海绵来源的smenospongine诱导乳腺癌MCF7细胞凋亡机制研究

目的 研究海绵Spongia pertusa Esper来源的smenospongine(Sme)诱导乳腺癌细胞MCF7凋亡的作用机制.方法 使用CCK-8法检测Sme对MCF7细胞活力的影响;DAPI染色检测凋亡细胞的细胞核形态;使用流式细胞术检测细胞凋亡率和线粒体膜电位;Western blotting检测Sme对Bax、Bcl2、细胞色素C(cytochorome C)、p-p38和p38蛋白水平表达的影响.结果 CCK-8法检测结果表明,Sme抑制MCF7增殖,IC50值为(16.46±0.88)μmol/L;DAPI染色结果和Annexin V-FITC/PI染色结果显示Sme诱导细胞凋亡.随着加药浓度的增加,细胞凋亡率从4.18％ 逐渐升至21.49％;流式细胞仪检测结果表明Sme引发MCF7细胞内线粒体膜电位下降;Western blotting结果显示Sme激活了内源性凋亡途径和p38丝裂源活化蛋白激酶(MAPK)信号通路.结论 Sme可能通过激活p38 MAPK通路,诱导细胞内源性凋亡发挥抗乳腺癌作用.

海蓬子皂苷甲通过mTOR信号通路诱导MCF7细胞发生自噬

目的 研究海蓬子皂苷甲(BA)诱导细胞自噬的作用及其机制.方法 采用倒置荧光显微镜法、流式细胞仪法和Western blot法从3个不同角度检测细胞自噬;免疫印迹法检测mTOR信号通路;MTT法检测BA单独或联合3-MA作用后细胞的存活率.结果 BA可诱导MCF7细胞发生自噬,具有剂量依赖性.BA可抑制mTOR磷酸化激活,抑制mTOR下游p70S6K蛋白丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)的磷酸化以及4EBP1的磷酸化.且随着BA浓度升高,Akt和p-ERK表达降低.3-MA与10 μmol·L-1 BA联合用药时,细胞存活率明显低于单独使用BA处理的细胞.结论 海蓬子皂苷甲通过抑制Akt和p-ERK蛋白表达,进而抑制mTOR激活,终诱导人乳腺癌MCF7细胞发生自噬.

佛波醇酯和三羟基异黄醇对雌激素受体阳性细胞中三苯氧胺作用的影响

探讨三苯氧胺作用的组织学特异性及乳腺癌内分泌治疗抵抗的可能机制.向MCF7及Hela细胞中转染入含周期素D1基因调控序列的报告基因,用佛波醇酯(TPA)、5,7,4-三羟基异黄醇(Genistein)处理细胞后,检测三苯氧胺对报告基因表达的调控作用.结果发现:MCF7细胞中,TPA可使三苯氧胺产生促进报告基因表达作用.Hela细胞中,Genistein预先作用12 h后,三苯氧胺表现出抑制报告基因表达作用.提示雌激素信号传导途径以外的蛋白激酶活性改变可明显影响三苯氧胺的作用,这可能是三苯氧胺作用的组织学特异性及乳腺癌内分泌治疗抵抗的机制之一.

去胰岛素的乳腺癌干细胞培养及雌激素诱导的作用

目的:探讨去除胰岛素的乳腺癌干细胞悬浮培养方法以及雌激素诱导的作用.方法:通过使用去除胰岛素的悬浮培养方法获得乳腺癌细胞系MCF7的肿瘤球细胞,并通过形态学观察、CD24-CD44+表达细胞的检测、醛脱氢酶1(ALDH1)蛋白的表达以及细胞多向分化能力对该干细胞模型的可靠性进行鉴定.给予10-10 mol/L 17β-雌二醇(E2β)对该干细胞模型处理7 d,观察上述相关指标的变化.结果:去除胰岛素的悬浮培养方法获得的瘤细胞球呈葡萄状,由30～60个细胞组成.细胞球显示细胞角蛋白18和CD10蛋白均表达阳性,CD44+CD24-细胞的含量及ALDH1蛋白表达量均较贴壁细胞明显增高(P<0.05).使用10-10 mol/L E2β处理MCF7肿瘤球细胞7 d,肿瘤球细胞数及体积增大.使用10-10 mol/L E2β处理MCF7肿瘤球细胞24 h,CD44+CD24-细胞数量及ALDH1蛋白表达量较未处理组明显升高(P<0.05).结论:去除胰岛素的悬浮培养方法可有效建立乳腺癌干细胞体外研究模型,并可用于E2β对乳腺癌干细胞生长调控的研究.

氯喹对MCF7细胞增殖的抑制作用及其机制

目的:探讨氯喹对乳腺癌细胞MCF7的生长抑制作用及其可能机制.方法:取对数生长期的MCF7细胞,用不同浓度氯喹(0、10、20、30、40 μmol/L)作用于MCF7细胞不同时间(0 h、24 h、48 h和72 h),通过MTT法检测细胞增殖情况.使用显微镜观察不同浓度氯喹作用 MCF7细胞72 h后细胞形态变化.利用Western blot方法检测不同浓度氯喹作用MCF7细胞24 h后细胞内β-catenin蛋白和Cyclin D1蛋白变化情况.结果:与对照组比较,氯喹在一定浓度范围内对MCF7细胞有明显的抑制作用(P<0.05),细胞增殖活性随着剂量和时间增加而逐渐下降.显微镜下观察到氯喹处理MCF7细胞后,细胞数目减少而细胞碎片增加.Western blot结果显示氯喹处理MCF7细胞后,细胞内β-catenin和Cyclin D1蛋白表达出现下调(P<0.05).结论:氯喹对MCF7细胞增殖具有抑制作用,其机制可能与下调Wnt/β-catenin信号通路有关.

水飞蓟宾抑制乳腺癌细胞增殖和促进其凋亡的作用及机制

目的:探讨水飞蓟宾抑制乳腺癌细胞增殖和促进其凋亡的作用及机制.方法:MCF7细胞分为对照组和SIL组(处理浓度分别为10、20、40mg/L),各组细胞分别处理24、48、72h.MTT法检测不同浓度SIL对乳腺癌MCF7存活率的影响,TUNEL法(DNA断裂的原位末端标记法)检测各组细胞凋亡率,caspase-Glo⑧3/7定量试剂盒测定细胞caspase3/7的表达情况,Westem blot法检测PUMA蛋白表达水平.结果:MTT结果显示SIL对MCF7细胞增殖有抑制作用(P＜0.01),其中用40mg/L SIL处理MCF7细胞72h时抑制效果明显,结果呈药物浓度时间依赖效应.TUNEL法显示(48h)SIL可以显著增加MCF7细胞的凋亡率(P＜0.01).caspase3/7结果示SIL可以使caspase3/7活性显著升高(P＜0.01).Western blot示SIL可以诱导PUMA蛋白的表达升高.结论:水飞蓟宾能抑制乳腺癌细胞增殖和促进其凋亡,其作用机制之一可能是诱导PUMA蛋白表达.