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甲基化XbaⅠ文献资料
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基因转运载体中甲基化XbaⅠ位点的体外克隆与应用
目的 探讨基因转运载体中甲基化XbaⅠ位点在基因克隆中的效用. 方法 以pIRES2-EGFP为母本,PCR扩增获得携附加XhoⅠ位点和满足甲基化序列组成的Xba Ⅰ位点、同时缺失IRES和EGFP区段的载体骨架p△SG,其PCR产物与携带对等酶切位点的EGFP PCR产物经酶切、连接后,构建重组质粒rp△SG-EGFPV-Xho、rp△SG-EGFPV-Xba.另将p△SG和EGFP的PCR产物分别与pMD 18-T Simple T载体连接,构建重组质粒psT-△SG和psT-EGFP,并亚克隆获得重组质粒rp△SG-sT-EGFPV-Xho.以DsRed2基因置换rp△SG-sT-EGFPV-Xho中的EGFP基因,获得重组质粒rp△SG-sT-DsRed2V-Xho.各重组质粒经脂质体介导转染CHO细胞. 结果 各重组质粒转染的细胞中明显可见EGFP或DsRed2的高效表达. 结论 PCR产物中满足甲基化序列组成的XbaⅠ位点,在体外酶切与连接的克隆效果良好；该序列经体外重组并导入Dam+和/或Dcm+宿主菌中扩增时被重新甲基化而受保护,且对重组质粒在宿主细胞内的稳定性和生物活性没有明显影响.
