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miR-200b调控肌球蛋白轻链激酶/磷酸化肌球蛋白轻链信号通路对肠上皮紧密连接的影响
目的：探究miR-200 b对肠上皮紧密连接的影响及作用机制。方法利用阴性对照慢病毒及表达miR-200 b的慢病毒感染Caco-2细胞形成NC株和200 b株，以10 ng/mL肿瘤坏死因子（TNF-α）处理建立体外肠上皮损伤模型，并分为NC组、NC+TNF-α组、200 b组和200 b+TNF-α组。测量4组细胞对肠上皮跨膜电阻抗（TEER）及对异硫氰酸荧光素-右旋糖酐（FITC-dextran）的通透性；Western blot检测肌球蛋白轻链激酶（MLCK）及磷酸化肌球蛋白轻链（P-MLC）表达。结果与NC组相比，NC+TNF-α组TEER值降低、对FITC-dextran通透量显著增高、MLCK和P-MLC表达上调，差异均有统计学意义（P
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Rho激酶在大鼠严重烧伤后肠黏膜通透性改变中的作用及机制研究
目的 观察严重烧伤早期不同时相点大鼠肠黏膜通透性的变化,探讨Rho激酶在这一过程中的作用及机制.方法 常规制备烧伤大鼠模型后取回肠末段,分为正常对照组、烧伤组和烧伤6 h+Y27632组,以荧光素标记法(FITC-D)检测大鼠肠黏膜在未烧伤、1、2.6、12、24 h等不同时相点通透性的变化指标;用Western blot法检测肠黏膜肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)、磷酸化MLC(p-MLC)和Rho激酶蛋白水平的变化.结果 严重烧伤后大鼠肠黏膜通透性明显增加,并呈时相依赖性变化,6～12 h达到高;p-MLC以及Rho激酶蛋白表达均明显增加.上述蛋白表达的增强可在加入Rho激酶特异性抑制剂Y27632后消失.结论 严重烧伤后肠黏膜Rho激酶激活和p-MLC表达增加,是导致其通透性增加及屏障功能损害的分子机制之一.
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严重烧伤后肠黏膜肌球蛋白轻链磷酸化表达改变及其意义
目的 探讨肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)磷酸化在严重烧伤早期对肠黏膜屏障功能及细胞紧密连接相关蛋白变化的作用.方法 健康成年SD大鼠48只,采用随机数字表法分为正常对照组及烧伤后1、2、6、12、24 h组,用异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-Dextran)检测大鼠肠黏膜通透性,免疫荧光法检测肠黏膜细胞紧密连接相关蛋白ZO-1、F-肌动蛋白(F-actin)及磷酸化型MLC(phosphorylated MLC,p-MLC)的变化.结果 烧伤后大鼠肠黏膜通透性明显增加,伤后6 h达高峰,为对照组的3倍(P<0.01);烧伤后肠上皮通透性的增加伴随有紧密连接相关蛋白ZO-1的明显重分布、细胞紧密连接损害以及肠上皮细胞p-MLC表达的增加.结论 MLC磷酸化可能在严重烧伤后肠黏膜屏障功能紊乱及通透性增加的发生机制中起着重要的调控作用.
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缺氧复氧后内皮细胞中PBEF与VEGF、p-MLC的相关性研究
目的探讨前β细胞克隆增强因子(PBEF)、血管内皮生长因子(VEGF)和肌球蛋白轻链磷酸化(pMLC)在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧复氧中的表达及相互间的相关性。方法体外常规培养HUVEC细胞,实验分为对照组、缺氧组和缺氧复氧组三组,每组10个培养板孔细胞；Western blot ing检测三组PBEF、VEGF和pMLC蛋白表达；并分析PBEF、VEGF和pMLC三组在HUVEC缺氧复氧中的相关性。结果 HUVEC细胞缺氧后,PBEF,VEGF和pMLC蛋白表达较对照组均显著升高(<0.01)；缺氧组HUVEC细胞复氧12h后,PBEF,VEGF和pMLC蛋白表达较单纯缺氧组进一步升高,比较差异有统计学意义(<0.01)。 PBEF、VEGF和pMLC蛋白在HUVEC缺氧复氧中的表达均呈正相关；PBEF和VEGF间的等级相关系数为0.493,PBEF和pMLC间的等级相关系数为0.534,VEGF和pMLC间的等级相关系数为0.469。结论 PBEF、VEGF和pMLC参与HUVEC缺氧复氧过程,且三者在HUVEC缺氧复氧中的表达之间均呈正相关。
关键词： 前β细胞克隆增强因子 血管内皮生长因子 肌球蛋白轻链磷酸化 缺氧复氧 -
缺氧血管内皮细胞Rho激酶信号通路活化与通透性的关系
目的 探讨缺氧时血管内皮细胞Rho激酶信号通路活化与通透性的关系. 方法 (1)将人血管内皮细胞株VE细胞接种于6孔板Transwell小室上,按随机数字表法分为对照组(未行缺氧处理)及缺氧1、2、3、6、12h组(分别缺氧处理相应时间),每组5孔.用蛋白质印迹法检测细胞中Rho激酶Ⅰ、Ⅱ及肌球蛋白轻链磷酸酶靶亚单位1(MYPT1)、磷酸化MYPT1( p-MYPT1)、肌球蛋白轻链(MLC)、p-MLC的蛋白表达,计算p-MYPT1/MYPT1、p-MLC/MLC比值.(2)将VE细胞接种于24孔板Transwell小室上,按随机数字表法分为对照组(未行缺氧处理)与缺氧6h组(缺氧处理6h),每组5孔,用荧光分光光度计检测单层细胞通透性.对数据进行单因素方差分析或t检验,多组间两两比较采用Newman-Keuls法. 结果 (1)对照组及缺氧1、2、3、6、12h组细胞Rho激酶Ⅰ蛋白表达量分别为0.63±0.14及0.36±0.08、1.25 ±0.21、1.98±0.16、1.49 ±0.38、0.79±0.24(F=36.52.P ＜0.01),其中缺氧2、3、6h组显著高于对照组(P值均小于0.01).各组细胞Rho激酶Ⅱ蛋白表达量比较,差异具有统计学意义(F =17.84,P＜0.01),其中缺氧2h组为1.33±0.17,显著高于对照组的1.05±0.04(P＜0.01).对照组及缺氧1、2、3、6、12h组细胞p-MYPT1/MYPT1比值分别为0.62±0.13及0.62±0.11、0.65 ±0.10、1.06±0.23、1.37 ±0.16、1.91±0.32(F=37.41,P＜0.01),其中缺氧3、6、12h组显著高于对照组(P值均小于0.01).对照组及缺氧1、2、3、6、12h组细胞p-MLC/MLC比值分别为0.72 ±0.19及0.83 ±0.17、0.91±0.15、1.39 ±0.16、2.02±0.15、0.90±0.25(F=36.92,P＜0.01),其中缺氧3、6h组显著高于对照组(P值均小于0.01).(2)缺氧6h组单层细胞通透性为36.1±8.0,显著高于对照组的9.1±2.1(t=7.30,P＜0.01). 结论 Rho激酶信号通路活化可能参与了缺氧引起的血管内皮通透性增加的发生.
