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人白细胞介素12的cDNA克隆及双顺反子腺病毒载体的构建
目的:克隆中国人IL-12的p40和p35亚基cDNA,构建含hIL-12双顺反子的腺病毒载体.方法:采用RT-PCR从上海地区人骨髓有核细胞中克隆IL-12的双亚基cDNA,并插入质粒pCI中进行全基因序列分析.利用质粒p△ElsplA和IRES序列构建同时表达p35和p40亚基的腺病毒载体.酶切鉴定构建物中基因插入的正确性.结果:上海地区人骨髓有核细胞中IL-12的p40和p35 cDNA基因同已报道的北京地区人DC细胞中IL-12的p40和国外报道的NKSF,CLMF的p40和p35序列各有异同,构建的IL-12双亚基同时表达的腺病毒载体酶切鉴定正确.结论:人IL-12的p40和p35基因可能存在多态性,同时表达IL-12双亚基的腺病毒载体构建成功,对开展人IL-12基因治疗肿瘤具有重要意义.
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经嵌合纤维蛋白Ad5/35修饰的双表达hIL-12和hIFN-α2a新型腺病毒载体的构建及体外实验研究
目的:构建经嵌合纤维蛋白Ad5/35修饰的双表达hIL-12和hIFN-α2a的新型腺病毒载体并进行体外实验研究.方法:采用常规基因克隆和同源重组技术,构建在E3区携带hIL-12B(p40)和在纤维蛋白及E4区之间携带hIFN-α2a及eGFP表达框的经嵌合纤维蛋白Ad5/35修饰的嵌合型腺病毒骨架质粒载体pAd5/35-Backbone.E3-CMV-hIL-12B(p40)/E4-hIFN-α2a-eGFP.此外,采用分子克隆手段构建携带hIL-12A(p35)的腺病毒E1穿梭载体pAd5-E1-CMV-hIL-12A(p35).PCR法鉴定腺病毒骨架载体及穿梭载体质粒.将上述所获得的两种质粒载体经过PacI线性化后共转染HEK293细胞包装新型病毒载体.将纯化的腺病毒感染人恶性胶质瘤细胞U87MG,48小时后,荧光显微镜下观察报告基因eGFP的表达,RT-PCR检测hIL-12及hIFN-α2a目的基因的表达.结果:PCR法检测到所构建的腺病毒骨架载体及穿梭载体质粒成功携带所需的目的基因.成功包装并纯化获得新型腺病毒载体pAd5/35.E1-CMV-hIL-12A(p35)/E3-CMV-hIL-12B(p40)/E4-hIFN-α2a-eGFP.体外感染U87MG细胞,48h后荧光显微镜下可以观察到报告基因eGFP的表达,RT-PCR可以检测到hIL-12及hIFN-α2a目的基因的表达.结论:体外实验结果表明,成功制备的经嵌合纤维蛋白Ad5/35修饰的双表达hIL-12和hIFN-α2a新型腺病毒载体,为进一步探讨其在恶性脑胶质瘤动物模型中的体内治疗研究奠定了基础.
