首页 > 文献资料
-
针对人NeuroD基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定
目的 构建并鉴定人神经源性分化蛋白基因(NeuroD) RNA干扰慢病毒表达载体.方法 根据已公布的NeuroD基因序列(GenBank:NM_002500),设计并合成4对shRNA(NeuroD1～D4),与载体pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miR连接,构建pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD表达载体,转化入感受态细胞DH5α; real-time PCR技术检测pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD表达载体对293T细胞内靶基因的干扰效果.将筛选出的干扰载体pcDNATM 6.2-GW/EmG-FP-miR-NeuroD1与慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST经酶切后连接,构建慢病毒表达载体pLenti6.3-EGFP-NeuroD1-miR.用构建的慢病毒表达载体和包装质粒(Packaging Mix)共转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超速离心浓缩,并测定滴度.采用PCR法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测.结果 成功构建针对靶基因的4个干扰质粒,测序结果表明,4个pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD表达载体序列与参考序列一致,real-time PCR检测显示以pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD1的沉默效应佳(P＜0.01).将重组获得的慢病毒表达载体pLenti6.3-EGFP-NeuroD1-miR转染至293T细胞株,酶切鉴定及PCR结果与病毒载体的预期一致,病毒滴度达1.18×108 ifu/mL.结论 成功构建、筛选了针对人NeuroD基因的RNA干扰慢病毒表达载体.
