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ssp411基因siRNA表达载体的构建与有效干扰质粒的筛选
目的 为探索精子细胞特异表达的新基因ssp411在受精及早胚发育中的功能,设计并构建了以ssp411基因为靶点的RNA干扰表达载体siRNA-ssp411s,筛选其中对ssp411基因有显著干扰作用的表达质粒.方法 根据已知的ssp411 mRNA序列,选择设计三条带发卡结构的核苷酸序列,克隆到含有U6启动子的载体pRNAT-U6.1中并测序分析.用脂质体转染的方法将干扰质粒与表达质粒ssp411-pDsRed共转染293T细胞,24h后,荧光倒置显微镜观察转染效率,并收集细胞,通过实时定量PCR方法检测不同干扰质粒对ssp411 mRNA的干扰效果.结果 3个ssp411的siRNA片断被成功克隆到pRNAT-U6.1质粒载体中,插入片段测序结果与设计的序列完全一致.实时定量PCR结果表明,针对ssp411基因蛋白编码区3-22序列构建的干扰质粒效果好,干扰效率可达71%.结论 成功构建了能表达ssp411 shRNA(small hairpin RNA)的重组质粒,同时通过共转染技术,筛选到一个干扰效果达70%以上的干扰片断,为建立转基因RNA干扰小鼠模型,在体内研究ssp411基因及蛋白的生殖生物学功能打好基础.
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RNAi沉默SSP411基因对人胆管癌HuCCA-1细胞增殖的影响
目的 研究RNA干扰(RNAi)对SSP411进行基因沉默后胆管癌细胞体外增殖的变化.方法 构建针对SSP411的RNAi质粒,将离体培养的胆管癌HuCCA-1细胞分为阴性对照(C)组、shRNA-SSP411 1转染(A1)组和shRNA-SSP411 2转染(A2)组.采用RT-PCR和Western blot法分别检测HuCCA 1细胞中SSP411 mRNA和蛋白表达；通过MTT实验、平板克隆形成和软琼脂克隆球形成能力检测,观察目的基因被下调后细胞增殖能力的变化.结果 A1、A2组细胞的SSP411 mRNA和蛋白表达较C组明显降低.与C组相比,A1、A2组胆管癌细胞生长被显著抑制(P＜0.01)；A1、A2组平板克隆形成数目低于C组[(66±18)个、(70±17)个vs.(115±16)个](P＜0.01或P＜0.05)；与C组相比,A1、A2组软琼脂克隆球数目显著下降[(96±29)个vs.(53±9)个、(43±13)个](P＜0.05).结论 RNAi介导的SSP411基因沉默可抑制人胆管癌HuCCA-1细胞的增殖能力；SSP411可作为胆管癌治疗的新靶点.
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ssp411基因敲除小鼠生育表型的初步研究
目的 对ssp41 1基因的生育功能进行初步研究.方法 利用PB转座子插入建立小鼠模型ssp411基因敲除小鼠各基因型之间交配后,检查雌鼠生殖道是否见栓.记录出生小鼠的窝仔数,性别,出生20 d仔鼠体质量、基因型等数据;记录出生后90 d雄仔鼠的睾丸重量,进行组织形态学研究,并对附睾尾精子进行活力分析.结果 ssp411缺陷型雌鼠可以正常生育,而雄鼠无自然生育能力.ssp411基因敲除雄鼠能够与母鼠自然交配形成阴道栓,但是没有子代出生,且在交配后母鼠输卵管壶腹部未见精子.睾丸的组织形态学研究和睾丸称量结果表明,ssp411蛋白缺失可以影响精子的生成.ssp411基因敲除雄鼠的附睾精子活力也明显差于对照组.结论 ssp411基因缺陷不影响雌性生殖,但影响雄鼠的精子生成功能,造成少弱精子症,并引起雄性不育.
