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利用CRISPR/Cas9技术构建tnnt2a基因突变斑马鱼及表型分析
心肌肌钙蛋白T (cardiac troponin T,cTnT)作为心肌纤维细肌丝的结构蛋白,参与心脏兴奋收缩耦联过程.tnnt2a为斑马鱼cTnT基因的亚型.本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了可稳定遗传tnnt2a缺失突变斑马鱼.对tnnt2a缺失突变体进行表型分析,结果显示tnnt2a+/-斑马鱼心脏无明显异常,而tnnt2a-/-斑马鱼心脏在胚胎发育早期具有显著的突变表型,表现为心脏无搏动、心房和心室增大、心包积液,并于受精后6～7天死亡.运用real time RT-PCR检测tnnt2a、actc1a、tpm4a、myl7和vmhc基因在转录水平的表达情况,结果显示tnnt2a-/-(A2)斑马鱼tnnt2a基因在发育的各时间点表达水平均显著下降;而actcla、tpm4a、myl7和vmhc基因在突变体胚胎发育早期表达增高,晚期则表达下降.进一步对心脏组织进行电镜观察和免疫荧光染色,结果显示tnnt2a-/-(A2)斑马鱼心脏无正常粗、细肌丝结构,同时F-actin与Tpm4的共染色也展示了心肌细胞肌丝结构的异常.本研究利用CRISPR/Cas9构建的tnnt2a突变斑马鱼表现出了心腔扩张,停搏及粗、细肌丝形成障碍等与临床扩张型心肌病相似的表型,因此可为TNNT2缺陷相关心肌病的研究提供很好的工具.
关键词： tnnt2a CRISPR/Cas9 斑马鱼
