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临床菌株耐药性分子检测技术的应用进展
临床菌株分子检测技术发展迅速.实时荧光定量PCR的应用已较为成熟;基因芯片、多重基因遗传信息表达分析系统对部分菌株耐药基因检测的方法已经建立;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术在菌株蛋白质分子及单核苷酸突变检测方面有独特优势;新一代DNA测序技术在简化实验流程的同时大幅削减成本,其应用可能为临床菌株鉴定及其耐药性检测带来新的革命.该文对上述几种分子检测技术在临床菌株耐药检测方面进行介绍,为临床应用与研究提供参考.
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引物标记技术的应用与葡萄球菌多重耐药基因检测法的建立
目的 基于多重基因遗传信息表达分析系统(GeXP)技术平台,应用CY5(荧光染料)标记的特异引物代替通用引物,建立一种高通量的葡萄球菌多重耐药基因检测法.方法 设计细菌16S rDNA、耐甲氧西林相关基因(mecA、MecA LGA251)与耐大环内酯类相关基因(ermA、ermB、ermC、sat4、msrA、ereA、ereB、mefA/E)的引物,经“PCR+琼脂糖电泳”筛查2014年1月-2016年12月中山大学附属第八医院129株耐甲氧西林或者耐红霉素葡萄球菌基因,同时优化PCR.用CY5标记上游引物5'端,制作GeXP多重PCR引物.应用多重PCR扩增多重耐药基因核酸,产物经琼脂糖电泳与GeXP毛细管电泳,分析电泳图优化PCR.应用优化后的GeXP多重PCR扩增43株葡萄球菌,验证应用效果.结果 129株葡萄球菌筛出7种基因(16S rDNA、mecA、ermA、ermB、ermC、sat4和msrA).16S rDNA、mecA、ermA、ermB、ermC和msrA引物特异性好,但不同核酸的sat4基因能扩增出两种不同大小片段.建立的GeXP多重PCR能同时检出所有靶基因.43株葡萄球菌的检测结果与表型检测(VITEKⅡCompact System)相符;与“PCR+琼脂糖电泳”相比:sat4符合率为97.67％(42/43),无统计学差异(P＞0.05);msrA符合率为95.35％(41/43),无统计学差异(P＞0.05);ermA、mecA、16S rDNA、ermB和ermC符合率均为100％(43/43).结论 采用CY5标记特异引物应用于GeXP系统检测葡萄球菌多重耐药基因的方法可行,其特异性与敏感性高,若采用更多引物,其检测通量可进一步提高.
