首页 > 文献资料
-
携带siRNA的慢病毒载体抑制自发性高血压大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞S1PR3的表达
目的:筛选出能够高效特异性沉默自发性高血压大鼠(SHR)阴茎海绵体平滑肌细胞(CCSMC)内1-磷酸鞘氨醇受体3(S1PR3)基因表达的siRNA慢病毒载体,并观察其对SHR CCSMC ROCK1、ROCK2、eNOS表达的影响. 方法:以大鼠S1PR3基因mRNA序列作为干扰靶点,设计并合成3对靶向S1PR3的siRNA序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3)及1对阴性对照序列,构建并包装成慢病毒载体.体外培养SHR CCSMC及魏-凯二氏大鼠(WKY) CCSMC,随机分为A组(SHR对照组)、B组(携带阴性对照病毒的SHR CCSMC转染组)、C～E组(分别携带靶向S1PR3基因siRNA 1～3号靶点慢病毒的SHR CCSMC转染组),F组(WKY对照组),以感染复数(MOI)=60转染SHR CCSMC,转染后观察细胞绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,并用RT-PCR和Western印迹检测转染后细胞中S1 PR3、ROCK1、ROCK2、eNOS mRNA及蛋白的表达情况. 结果:经基因测序证明慢病毒载体构建成功.荧光显微镜下观察B～E组细胞转染效率均＞80％.与A组相比,B组S1PR3、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白的表达均无明显改变(P均＞0.05),C、D、E、F组的S1PR3、ROCK1、ROCK2mRNA及蛋白的表达均较A组显著下降(P均＜0.05),其中E组抑制作用为明显,使S1PR3 mRNA及蛋白表达的抑制效率分别为(34.2±2.9)％、(77.7±4.7)％;ROCK1 mRNA及蛋白表达的抑制效率分别为(33.3±1.4)％、(51.1±7.3)％;ROCK2mRNA及蛋白表达的抑制效率分别为(30.8±3.6)％、(58.32±5.5)％.A组eNOS mRNA及蛋白表达分别与B、C、D、E比较无明显差异(P均＞0.05),但较F组显著降低(P＜0.05);与F组比较,E组S1 PR3、ROCK1、ROCK2mRNA及蛋白的表达均无明显改变(P均＞0.05),A、B、C、D组的S1PR3、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白表达均显著高于F组(P均＜0.05),A、B、C、D、E组eNOS mRNA及蛋白表达均较F组显著降低(P均＜0.05). 结论:本研究构建的3条携带不同位点的S1 PR3基因的siRNA慢病毒载体均能够显著抑制SHR CCSMC内S1PR3基因的表达,并能有效抑制SHR CCSMC中上调的RhoA/Rho激酶信号通路,其中携带siRNA3慢病毒载体的抑制效率高.
-
1-磷酸鞘氨醇受体3在心血管系统中的作用
1-磷酸鞘氨醇受体是1-磷酸鞘氨醇在细胞内发挥作用的重要靶点,包括5种亚型,广泛存在于包括心血管系统在内的各系统.近年来,许多研究发现1-磷酸鞘氨醇受体3在血管舒张、血管屏障功能、缺血再灌注损伤和动脉粥样硬化等过程中具有重要的生物学作用.现就1-磷酸鞘氨醇受体3在心血管系统中的作用及其机制做一综述.
关键词： 1-磷酸鞘氨醇受体3 G蛋白偶联受体 心血管系统 -
靶向S1PR3基因shRNA慢病毒表达载体构建及功能鉴定
目的：构建靶向小鼠S1PR3基因的shRNA慢病毒表达载体，并验证其对内皮祖细胞迁移能力的影响。方法依照shRNA设计原则，合成对应的shRNA序列，将其克隆到PHBLV载体中，使用三载体系统进行病毒包装，收集制备成功的病毒，并用荧光显微镜法测定病毒滴度，使用病毒感染EPC后，测定各组细胞中S1PR3蛋白表达情况，选择合适的病毒感染EPC后，测定其对EPC迁移能力的影响。结果成功将shRNA序列克隆到慢病毒表达载体PHBLV-U6-RFP，表达质粒与辅助质粒共转染293细胞后48 h就可以看到细胞中成功表达红色荧光。收集培养成功病毒感染小鼠EPC，可以不同程度干扰细胞中S1PR3蛋白表达，S1PR3蛋白表达受到抑制后，EPC的迁移能力明显减弱。结论我们成功构建了可以有效干扰S1PR3表达的慢病毒载体，并初步观察了其对EPC细胞的迁移能力的影响，为后续进一步调控S1PR3相关的细胞功能的研究奠定了基础。
关键词： 慢病毒 1-磷酸鞘氨醇受体3 内皮祖细胞 细胞迁移 -
小鼠S1PR3慢病毒表达载体的构建及表达
目的：构建小鼠1-磷酸鞘氨醇受体3(S1PR3)慢病毒表达载体，并检测其表达情况。方法小鼠心肌组织mRNA并逆转录得到cDNA，设计并合成引物，采用亚克隆方式将目的基因克隆至慢病毒表达载体pLent-IRES-EGFP中，将表达载体与包装质粒共转293T细胞，进行目的基因的过表达慢病毒包装，随后收集培养成功病毒，使用病毒感染小鼠L929细胞，检测感染后L929细胞表达S1PR3情况。结果从小鼠心机组织cDNA中扩增出大小约1100 bp的目的片段；双酶切后成功将S1PR3克隆到慢病毒表达载体pLent-IRES-EGFP，表达质粒与包装质粒供转染293细胞后48 h就可以看到细胞中成功表达绿色荧光。收集培养成功病毒感染小鼠L929细胞，成功表达出S1PR3。结论本研究成功构建了可以高表达S1PR3的pLenti6.3-S1PR3-IRES-EGFP慢病毒表达载体，为进一步调控S1PR3相关的细胞功能奠定了基础。
关键词： 慢病毒 1-磷酸鞘氨醇受体3 血管损伤 再内皮化
