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PCR反向线点杂交鉴定常见念珠菌的研究
目的 建立PCR反向线点杂交技术(PCR-RLB)快速检测和鉴定常见念珠菌的方法.方法 以念珠菌属间隔序列Ⅱ(ITS2)为靶基因设计通用引物,用生物素标记反义引物,PCR扩增白念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念球菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌DNA,然后与通过氨基标记固定在尼龙膜上的各特异性寡核苷酸探针杂交,并进行临床标本和分离株的检测.结果 念珠菌标准菌株可扩增出302～441 bp DNA片段,6种特异性寡核苷酸探针可分别与相应念珠菌PCR产物杂交,其敏感性为10 cfu/mL.通过对100例分离株的检测,然后与培养法鉴定(Merieux Vitek)的结果比较,有97株与培养结果一致,另外3株通过DNA测序结果证实与PCR-RLB测定结果一致.通过对200例女性阴道拭子进行检测,PCR-RLB阳性率为49%,而涂片法和培养法阳性率分别为27%和39%,明显高于涂片法和培养法(P＜0.05).结论 该方法可快速、敏感、准确鉴定临床上常见的念珠菌.
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三种方法在检测泌尿生殖道淋病奈瑟菌感染中的比较研究
目的 比较反向线点杂交技术(RLB)、实时荧光PCR (FQ-PCR)及培养法在检测泌尿生殖道淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)感染中的应用情况.方法 同时采集158例患者2份泌尿生殖道标本,提取其中1份标本NG-DNA,PCR扩增NG 16S rRNA基因,然后与固定在尼龙膜上的特异性寡核苷核探针反向线点杂交;同时运用FQPCR检测NG的感染情况;另1份标本及时进行NG巧克力培养.结果 PCR扩增NG 16S rRNA基因的片段长度为412bp,具有较好的特异性,RLB检测158例标本中NG阳性为45例,阳性率为28.48％;FQ-PCR检测NG阳性为50例,阳性率为31.65％,二者比较差异无统计学意义(P＞0.05);而培养法检测NG阳性为25例,阳性率为15.82％,明显低于RLB和FQPCR(P＜0.01).结论 与培养法相比,RLB与FQ-PCR在检测NG方面具有简便、快速且敏感性高等优点,且二者无明显差别.
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PCR-RLB技术同时检测淋病奈瑟菌 Opa和16S rRNA基因的研究
目的 建立和评价一个新的多重PCR-反向线点杂交技术(RLB)检测淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)的方法.方法 选择NG Opa基因和16S rRNA基因分别设计两对PCR引物,生物素标记下游引物.构建二重PCR扩增NG DNA,然后与固定在尼龙膜上的特异性寡核苷核探针杂交.并对117例经荧光定量PCR(FQ-PCR)检测的标本进行检测.结果 多重PCR两对引物均可扩增3株NC标准菌株DNA,其中Opa和16S rRNA PCR产物的片段长度分别为89bp和414bp.43份FQ-PCR NG阳性标本中31份16S rRNA PCR-RLB阳性,而Opa PCR-RLB均检测为阳性,31份二者均为阳性.74份FQ-PCR NG阴性标本中64例Opa PCR-RLB阴性,73例16S rRNA PCR-RLB阴性,64份二者同时为阴性.结论 多重PCR-RLB检测NG是一种简便、快速及有效的方法,为无症状人群NG感染的初筛和准确诊断提供了一种可靠的方法.
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多重PCR-反向线点杂交技术在检测女性念珠菌和阴道毛滴虫感染中的应用
目的 建立和评价多重PCR-反向线点杂交技术(mPCR-RLB)快速同时检测阴道毛滴虫和念珠菌感染的方法.方法 分别选择阴道毛滴虫特异性DNA重复序列设计一对特异性引物,以念珠菌属28s rRNA 至5.8s rRNA间隔序列Ⅱ(ITS2)为靶基因设计一对检测念珠菌的通用引物,构建二重PCR同时扩增阴道毛滴虫、白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念球菌、近平滑念珠菌、都柏林念株菌DNA,然后与通过氨基标记固定在尼龙膜上的各特异性寡核苷核探针杂交,并对女性阴道试子标本进行检测.结果 多重PCR可同时扩增阴道毛滴虫、白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念球菌、近平滑念珠菌、都柏林念株菌临床或标准菌株DNA,上述念珠菌标准菌株可扩增出302～441bp DNA片段,阴道毛滴虫临床株可扩增出262bp DNA片段.6种念珠菌和阴道毛滴虫的特异性寡核苷酸探针可分别与其相应的PCR产物杂交.通过对150例女性阴道试子进行检测,mPCR-RLB检测念珠菌的阳性率为47.33%,阴道毛滴虫的阳性率为6.67%,二者同时阳性率为1.33%.而培养法检测念珠菌阳性率为36.00%,阴道毛滴虫的阳性率为2.00%,二者同时阳性率为0.67%.明显高于培养法(P<0.05).结论 多重PCR-RLB可快速同时检测念珠菌和阴道毛滴虫,为女性阴道炎的临床诊断提供了一种可靠的方法.
