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m4AChR-Gilα融合蛋白的建立、表达及几种配体对其机能的影响
目的通过Baculovirus-Sf9细胞系统制备并表达m4AChR-Gilα融合蛋白,检测几种配体对融合蛋白质中m4AChR与Gilα间相互作用,并以该融合蛋白质为工具,筛选m4AChR的特异性配体.方法两步聚合酶链反应建立m4AChR-Gilα融合cDNAs,并在Sf9细胞内表达.通过[3H]QNB和[35S]GTPγS替代结合实验研究几种配体乙酰胆碱、卡巴胆碱、AF-102B、prifinium、AF-DX116和阿托品对m4AChR-Gilα融合蛋白的作用.结果m4AChR-Gilα融合蛋白表达水平为(47.04±1.58)pmol/g蛋白,不同配体使融合蛋白质中Gilα与二磷酸鸟苷的亲和力发生变化.结论杆状病毒表达的m4AChR-Gilα融合蛋白具备m受体配体结合特性和组分间的偶联功能.配体通过改变融合蛋白质中Gilα与二磷酸鸟苷的亲和力,活化该融合蛋白质.
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GDP对大鼠脑线粒体呼吸氧耗的抑制作用及其对膜电位的影响
目的 通过观察二磷酸鸟苷(guanosine diphosphate, GDP)对大鼠脑线粒体呼吸氧耗作用的量-效关系及对膜电位的影响,探讨脱偶联蛋白(uncoupling proteins, UCPS)活性改变与线粒体呼吸氧耗和膜电位的关系.方法 应用差速离心法提取大鼠脑线粒体,分别在不同浓度GDP干预下采用Clark氧电极法测定线粒体呼吸氧耗并计算Ⅲ态呼吸(state 3 respiration, ST3)、Ⅳ态呼吸(state 4 respiration, ST4)、呼吸控制率(respiratory control rate, RCR)、氧化磷酸化效率(oxidative phosphorylation, OPR)和采用Rhodamine123法测定线粒体膜电位(MMP).结果 大鼠脑线粒体ST3、ST4、RCR、OPR随GDP的浓度改变而改变;当GDP的浓度为0～1.4 mmol/L时,呈剂量依赖关系;当GDP达到1 mmol/L时抑制作用明显,抑制率达51.3%;大于或小于1 mmol/L时其抑制率均降低;在GDP对呼吸氧耗抑制率高时MMP高.结论 UCPS的抑制剂(GDP)可直接抑制分离的大鼠脑线粒体呼吸氧耗和MMP,并呈一定的量-效关系,提示UCPS活性改变可影响线粒体呼吸氧耗和MMP.
