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PKGⅡ对乳腺癌MC F-7细胞株中抑癌基因蛋白表达的影响
目的：研究乳腺癌MCF-7细胞株中PKGⅡ对抑癌基因PTEN、p21、p53、BRCA1以及BRCA2蛋白表达的影响。方法：用编码PKGⅡ cDNA的腺病毒载体感染MCF-7细胞，使其高表达PKGⅡ并以相应激活剂8-pCPT-cGMP激活；蛋白质印迹法检测MCF-7细胞p53、p21、PTEN、BRCA1以及BRCA2因子表达量。结果：PKGⅡ表达增高并激活后可使乳腺癌MCF-7细胞株中抑癌基因的蛋白表达降低。结论：PKGⅡ通过降低癌细胞的活动水平从而降低抑癌基因蛋白的表达。
关键词： MCF-7细胞 Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶 抑癌基因 -
Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶抑制VEGFR2介导的人胃癌HGC-27细胞增殖
目的:探讨Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶(typeⅡcGMP-dependent protein kinase,PKGⅡ)对血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)介导的人胃癌HGC-27细胞增殖的影响及其作用机制.方法:应用编码PKGⅡcDNA的腺病毒(Ad-PKGⅡ)感染HGC-27细胞,使其高表达PKGⅡ,并以特异性激动剂8-pCPT-cGMP激活PKGⅡ.应用血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)激活VEGFR2.MTT法检测细胞增殖;蛋白质印迹法检测p-VEGFR2、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated-protein kinase B,p-PKB/p-Akt)和磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(phosphorylated-extracellular signal-regulated kinase,p-ERK1/2)表达;免疫共沉淀法检测PKGⅡ与VEGFR2的结合;免疫沉淀法联合蛋白质印迹法检测PKGⅡ对VEGFR2丝氨酸/苏氨酸(Serine/Threonine,Ser/Thr)的磷酸化作用.结果:VEGF-A可促进HGC-27细胞增殖,并诱导胞内p-VEGFR2、p-Akt和p-ERK1/2表达水平明显升高;以Ad-PKGⅡ感染HGC-27细胞使其高表达PKGⅡ并激活后,VEGF-A引起的细胞增殖受到明显抑制,p-VEGFR2、p-Akt和p-ERK1/2表达水平显著降低;PKGⅡ可与VEGFR2相互作用,使后者丝氨酸/苏氨酸磷酸化.结论:激活的PKGⅡ可通过使VEGFR2发生丝氨酸/苏氨酸磷酸化抑制人胃癌HGC-27细胞的VEGFR2酪氨酸磷酸化,进而抑制其下游的增殖相关信号转导,终抑制该细胞的增殖.
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Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶重组腺病毒载体的构建、鉴定及初步应用
目的: 构建携带Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶(PKGⅡ)基因的重组腺病毒载体,并以此初步研究PKGⅡ对增殖相关的MAPK信号转导的影响.方法: 将PKGⅡ cDNA片段自载体pRC/CMV-GKⅡ(wt)中切出,克隆至穿梭质粒pENTR 1A,用ClonaseⅡ将pENTR-PKGⅡ中的PKGⅡ cDNA片段定向克隆到pAd/CMV/V5-DEST中构建pAd/CMV/V5-DEST-PKGⅡ(Ad-PKGⅡ).重组质粒Ad-PKGⅡ用PacⅠ酶酶切,使其线性化,再用脂质体转染法转染HEK293A细胞进行包装和扩增,微量全细胞病变法检测病毒滴度,蛋白质印迹法检测重组腺病毒Ad-PKGⅡ感染细胞后PKGⅡ的表达以及MAPK通路关键成分胞外信号调节激酶(ERK)活性的变化.结果: 重组腺病毒滴度达5×109 pfu/ml,蛋白质印迹法检测显示重组腺病毒感染CS54细胞后使其PKGⅡ表达明显增高;在BGC-823胃癌细胞株, PKGⅡ对EGF导致的ERK的激活有明显抑制作用.结论: 成功构建了携带PKGⅡ基因的重组腺病毒,初步证明PKGⅡ对细胞增殖相关信号转导有抑制作用,为进一步研究PKGⅡ与肿瘤细胞发生发展的关系提供了基础.
关键词： Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶 腺病毒载体 DNA重组 胞外信号调节激酶 -
Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶在胃癌组织中的表达
目的:探讨Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶 (tpye Ⅱ cGMP dependent protein kinase,PKGⅡ)在原发性胃癌组织中的表达及其在胃癌发生发展中的意义.方法:选择50例原发性胃癌组织、50例正常胃黏膜组织,应用免疫组化SP法和逆转录PCR法分别检测PKGⅡ蛋白和mRNA表达水平.结果:PKGⅡ在正常胃黏膜组织中表达较高,在胃癌组织中表达明显降低(P＜0.05),相关性分析结果显示PKGⅡ的表达与胃癌细胞的分化程度相关.结论:PKGⅡ在胃癌组织中表达明显降低,可能与胃癌的发生发展有关.
关键词： Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶 免疫组化 RT-PCR 胃癌
