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IκBα显性负相重组慢病毒载体的构建及其在NF-κB信号通路中的功能验证
目的:构建表达IκBα显性负相结构(dominant-negative construct,IκBα-DN)的重组慢病毒载体,并检测其对核转录因子-κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路的影响.方法:PCR扩增IκBα-DN片段并插入至pCDH-CMV-MCS-EFI-copGFP载体中.将构建的pCDH-IκBα-DN重组质粒与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293 T细胞,包装表达IκBα-DN的重组慢病毒,并用梯度稀释法检测病毒滴度.以慢病毒IκBα-DN感染293 T细胞,通过免疫印迹检测IκBα蛋白的表达量.将慢病毒IκBα-DN感染已转染有NF-κB虫荧光素酶报告质粒的293 T细胞,24 h后检测IκBα-DN对NF-κB活性的影响.进一步用慢病毒IκBα-DN感染表达卡波氏肉瘤病毒(Kaposi,s sar-coma-associated herpesvirus,KSHV)编码的病毒FLICE抑制蛋白(viral FLICE inhibitory protein,vFLIP)的人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),以检测IκBα-DN在NF-κB信号通路中的功能.结果:限制性内切酶鉴定以及核酸序列比对证实重组质粒pCDH-IκBα-DN构建成功.通过三质粒包装系统包装表达IκB α-DN的重组慢病毒,病毒滴度约为3×107 efu/mL.以慢病毒IκBα-DN感染293 T细胞,免疫印迹结果表明胞质中IκB α蛋白的表达量明显升高.虫荧光素酶报告实验结果提示,重组慢病毒介导的IκBα-DN能有效抑制NF-κB的活性.在表达KSHV vFLIP的HUVECs中,IκBα-DN也能显著减弱NF-κB通路信号.结论:成功构建的含IκBα-DN序列的慢病毒能够有效地感染293 T细胞和内皮细胞,且初步结果提示IκBα-DN能增加胞质内IκB的含量,并进一步抑制NF-κB信号的传递.
