首页 > 文献资料
-
水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂表达载体的构建与表达
目的:构建水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂(leech derived tryptase inhibitor,LDTI)原核表达载体,并在大肠埃希菌[BL21(DE3)]中高效表达重组蛋白.方法:以含有目的核酸序列的质粒为模板,通过PCR技术扩增出LDTI蛋白编码序列,构建含目的片段的T克隆载体以及原核表达载体pEl28a-LDTI重组质粒亚克隆,进行限制性内切酶双酶切鉴定和核酸序列分析,然后将该质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导,以Trieine-SDS-PAGE和蛋白质印迹方法分析和鉴定重组蛋白的表达.结果:成功构建了水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂原核表达载体pET28a-LDTI,并获得相应的融合蛋白;本实验证明,LDTI在大肠埃希菌工程菌中高效表达,在温度为33℃,IPTG浓度为0.7 mmol,诱导时间为1h,所表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的15%左右.结论:成功构建了LDTI原核表达载体并使其在原核系统中高效表达,为进一步研究水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂的生化特性和生物学功能奠定了良好的基础.
关键词： 构建 原核表达 水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂 -
LDTI抑制肥大细胞类胰蛋白酶活性并阻断其抑制胆固醇流出能力的研究
目的:肥大细胞(MCs)类胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,目前未发现其体内内生的抑制剂.本研究用水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂(LDTI)研究MCs颗粒释放液抑制THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的机制.方法:用Compound 48/80刺激大鼠腹腔MCs活化,制备颗粒释放液.荧光分光光度仪检测MCs组胺释放率.采用丙酮抽提LDTI并用反相高效液相纯化.酶法检测MCs颗粒释放液中类胰蛋白酶的活性.用15%非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳检测HDL3的改变.用高效液相色谱检测细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)含量,液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出.结果:MCs颗粒释放液使泡沫细胞内胆固醇流出减少,总、游离胆固醇蓄积增加,HDL3的载脂蛋白A-I降解;而用LDTI抑制MCs颗粒释放液中类胰蛋白酶的活性后,可取消MCs颗粒释放液的这些作用.结论:LDTI能抑制MCs颗粒释放液的作用,表明类胰蛋白酶可以抑制胆固醇外流,而且与HDL3的apoA-I的降解有关.
关键词： 肥大细胞 类胰蛋白酶 水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂 高密度脂蛋白3 胆固醇流出
