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人SMOC1重组腺病毒载体的构建及其在主动脉瓣间质细胞中的表达
目的:利用AdEasyTM vector system构建携带人SMOC1基因的重组腺病毒表达载体,感染人主动脉瓣间质细胞(hAVICs)并检测外源性SMOC1在细胞中的表达和对细胞增殖的影响.方法:用PCR的方法扩增SMOC1 cDNA,将其克隆到pGEM-T Easy载体中并测序鉴定.经NotⅠ和Xho Ⅰ双酶切后接入pShuttle-CMV穿梭载体,构建重组腺病毒的穿梭质粒pShuttle-CMV-SMOC1.将经PmeⅠ线性化的pShuttle-CMV穿梭载体与pAdEasyTM DNA电穿孔共转化BJ5183重组细菌,获取重组腺病毒质粒pAdEasy-SMOC1,再将经PacⅠ线性化的重组病毒骨架质粒转染HEK293A包装细胞,包装并扩增重组腺病毒(Ad-SMOC1).用Ad-SMOC1感染hAVICs,以Western blot法和免疫荧光染色法检测重组SMOC1在hAVICs中的表达与定位,用MTS法检测SMOC1对主动脉瓣间质细胞增殖的影响.结果:成功构建并包装表达SMOC1蛋白的重组腺病毒,该重组腺病毒在体外能有效感染hAVICs并高表达SMOC1蛋白,且其介导表达的SMOC1蛋白主要定位于hAVICs的胞浆和胞膜上,MTS分析表明重组SMOC1能够显著促进主动脉瓣间质细胞的增殖.结论:成功地构建了携带入SMOC1基因的重组腺病毒,并证实SMOC1具有促进增殖的作用.本研究为进一步研究SMOC1在瓣膜间质细胞中的作用奠定了实验基础.
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PI16重组腺病毒表达载体的构建及其在人主动脉瓣间质细胞中的表达
目的 构建携带人肽酶抑制蛋白16(PI16)基因的重组腺病毒表达载体,并研究其在人主动脉瓣间质细胞(hAVICs)中的表达.方法 合成带有EcoRⅠ酶切位点的PI16引物,PCR扩增PI16基因,将目的基因克隆到穿梭载体pAV-MCMV-GFP-3FLAG中,PCR及测序鉴定穿梭质粒pAV-MCMV-PI16-GFP-3FLAG.将穿梭质粒与辅助质粒pBHGlox(delta) E1,3Cre共转染HEK 293细胞,获取重组腺病毒Ad-MCMV-PI16-GFP-3FLAG.转染HEK 293细胞大量扩增后,采用CsCl梯度离心法纯化病毒,半数组织培养感染剂量(TCID50)法测定病毒滴度.用Ad-MCMV-PI16-GFP-3FLAG感染hAVICs,Western blot检测PI16在hAVICs中的表达.结果 成功构建了表达PI16蛋白的重组腺病毒,滴度达到5.01×10TCID50/ml,转染hAVICs后能高效地表达PI16蛋白.结论 成功构建携带人PI16基因的重组腺病毒,为进一步研究PI16基因的作用提供了基础.
