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三维共培养对髓核细胞与骨髓间充质干细胞增殖的影响
目的 建立椎间盘髓核细胞(NPCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)支架三维共培养系统.方法 分别培养乳兔NPCs和BMSCs至原代融合和第3代,将两种细胞按2:1 (BMSCs:NPCs)比例混匀,以6×106/ml的终浓度分别接种于培养板作为平面共培养组(A组)和PLGA支架(直径10 mm,厚3 mm)作为三维共培养组(B组)；每组各接种6例标本,每例接种细胞悬液100μl,体外培养2周,利用倒置显微镜、扫描电镜进行细胞形态学观察；MTT法测定各组细胞增殖情况.结果 细胞与材料支架黏附良好.经过2周的培养,A组和B组细胞均能够增殖；与A组相比,B组细胞增殖率增高(P＜0.01).结论 共培养的NPCs和BMSCs均能够与PLGA支架很好地黏附并增殖；PLGA支架三维共培养NPCs和BMSCs较平面共培养更能促进细胞增殖.
关键词： 椎间盘组织工程 髓核细胞 骨髓间充质干细胞 聚乳酸-乙醇酸共聚物支架 -
PKH26标记结合活体荧光成像技术在椎间盘组织工程研究中的应用
目的 体外评估PKH26标记对山羊髓核细胞生物学功能的影响,并结合活体荧光成像系统评价种子细胞在裸鼠体内的生物学行为. 方法 取1岁龄山羊椎间盘分离髓核组织,通过酶消化法获取原代细胞,倒置相差显微镜下观察,传代获取第1代髓核细胞,行PKH26荧光标记,荧光显微镜下观察标记后的细胞荧光强度,并行甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色观察,锥虫蓝染色比较标记前后细胞活性,MTT法检测标记前后细胞增殖特性,实时荧光定量PCR检测细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖基因表达.将标记后的髓核细胞接种至一体化纤维化-髓核支架的髓核部分,纤维环部分作为阴性对照,体外培养3d后植入5只6周龄雄性裸鼠体内,培养6周后活体成像技术检测髓核细胞-支架复合物在体内的荧光强度及范围. 结果 倒置相差显微镜观察示原代髓核细胞簇状生长,呈卵圆形,第1代髓核细胞呈类软骨样细胞形态；标记后的第1代髓核细胞甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色均呈阳性；标记后荧光强度均匀,标记前后细胞活性均在95％以上；标记前后细胞生长曲线比较差异无统计学意义(P＞0.05)；实时荧光定量PCR检测示标记前后细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因相对表达量差异均无统计学意义(P＞0.05).活体成像技术显示体内髓核支架有强烈荧光,纤维环支架未见荧光. 结论 PKH26标记对髓核细胞的活性、增殖及细胞表型的表达无明显影响,结合体内活体荧光成像系统可以追踪细胞在体内的生物学行为.
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hBMSCs诱导分化类髓核细胞
目的 探讨人椎间盘细胞和关节软骨细胞的分子表型差异,分析hBMSCs经TGF-β,和BMP-7联合诱导后能否分化为软骨细胞和髓核细胞.方法 取9例自愿捐赠者髂嵴骨髓20～40 mL分离培养hBMSCs.取第4代hBMSCs行三维微球培养.根据基础培养基中加入的生长因子不同,实验分成4组,分别为加入10 ng/mL TGF-β3组(A组)、200 ng/mL BMP-7组(B组)、同时加入两种生长因子组(C组)以及空白对照组(D组).于培养后21 d,行组织学及免疫组织化学观察:于培养后4、21 d进行PCR检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅹ型胶原、蛋白多糖和SOX9基因的表达.结果 培养后21 d,HE染色示A组和C组细胞呈软骨细胞样形态特征,甲苯胺蓝染色及免疫组织化学染色Ⅱ型胶原表达呈阳性.B组和D组细胞形态无明显改变,PCR检测示培养后21 d,A、C组SOX9、蛋白多糖、Ⅰ型胶原及Ⅱ型胶原表达较4 d时明显增加(P＜0.05).B、D组Ⅰ型胶原表达较4d时明显增加(P＜0.05),SOX9、蛋白多糖及Ⅱ犁胶原较4d时无明显变化(P＞0.05).其中仅A组X型胶原表达呈阳性.结论 TGF-β,和BMP-7联合应用能促进hBMSCs分化更接近于椎间盘细胞,可能为椎间盘组织工程提供种子细胞.
