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应用RNA干扰技术检测ASCT2功能
目的 谷氨酰胺( glutamine,GLM)是肠道细胞的主要氧化燃料,必须通过载体的转运才能进入细胞内,其中载体ASCT2起重要作用,文中将应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术研究肠黏膜上皮细胞株(intestinal epithelial cell,IEC)-6细胞膜GLN载体ASCT2的转运功能.方法 体外培养IEC-6,RNAi慢病毒颗粒进行细胞感染,3d后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达情况,5d后采用RT-PCR检测载体ASCT2的mRNA表达,7d后采用Western blot检测其蛋白表达,同时测定[3H]-L-GLN摄取率.结果 病毒转染细胞中均有GFP表达,载体ASCT2的mRNA表达下降60％,蛋白表达几近消失,[3H]-L-GLN摄取率下降15％.结论 通过慢病毒载体介导的RNAi这一方便有效的方法,证实了ASCT2载体在整个细胞的GLN转运中起15％以上的作用.
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肠黏膜上皮细胞的载体分布及功能
目的:谷氨酰胺是肠道细胞的主要氧化燃料,必须通过载体的转运才能进入细胞内.研究IEC-6细胞膜上分布的谷氨酰胺载体种类及其功能. 方法:体外培养肠黏膜上皮细胞株IEC-6,检测细胞膜上不同谷氨酰胺载体(ASCT2、SN1、SN2、ATA1、ATA2、LAT1、LAT2)的mRNA;检测载体ASCT2蛋白;测定不同载体对同位素标记谷氨酰胺的转运特性. 结果:在IEC-6细胞膜上载体ASCT2、SN1、ATA1、LAT1、LAT2的mRNA均得以表达.细胞外缓冲液中Na+存在时,[3H]-谷氨酰胺摄取率为(164.07±37.94)fmol/(mg protein·10min);Na+不存在时,[3H]-谷胺酰胺摄取率为(58.71±10.51)fmol/(mg protein·10min);饱和剂量甲氨基异丁酸(methylamino-isobutyric acid,MeAIB)阻断A类载体后,[3H]-谷氨酰胺摄取率为(81.02±19.59)fmol/(mg protein·10min). 结论:在IEC-6细胞膜上可能存在载体ASCT2、SN1、ATA1、LAT1、LAT2;Na+依赖性氨基酸载体起主要作用(约64.22%),其中A类载体占50.62%,非A类载体占13.60%,非Na+依赖载体起次要作用(35.78%)
