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胸腺基质淋巴细胞生成素和白细胞介素-4在变应性结膜炎鼠模型中的促炎作用
背景 研究表明胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)为类白细胞介素(IL)-17的炎性细胞因子,在多种变应性疾病的发生和发展中发挥关键作用,但是尚未见到关于TSLP是否参与中国常见变应原诱导的变应性结膜炎的报道. 目的 研究TSLP和IL-4在由中国常见的黄花蒿诱导的变应性结膜炎小鼠模型眼表组织和颈部淋巴结中的表达变化,探讨TSLP和IL-4在变应性结膜炎发病中的作用. 方法 采用随机数字表法将6～8周龄雌性BALB/c小鼠20只随机分为正常对照组和模型组.将400μl黄花蒿花粉提取液溶解于400μl变应原(抗原)溶媒中制备成抗原溶液,将50μl抗原溶液注射于模型组小鼠足底皮垫下初次致敏,于注射后第10 ～12天用黄花蒿花粉提取液局部点右眼再次致敏,每日点眼1次;正常对照组小鼠未做任何处理.于造模后第13天采用颈椎脱臼法处死小鼠并摘取眼球,在眼科显微镜下各组分别取16只小鼠32只眼角膜上皮、结膜和颈部淋巴结组织,采用实时定量PCR法检测各种靶组织中TSLP mRNA及IL-4 mRNA的相对表达量,另每组各取4只小鼠8只眼眼睑及眼球制备石蜡切片,采用免疫组织化学法检测角膜、结膜及结膜下组织中TSLP和IL-4蛋白的表达. 结果 模型组小鼠第2次致敏后0.5h可见小鼠眼睑水肿、结膜充血水肿、溢泪、搔抓眼睑等症状,症状持续6 ～24 h,造模成功率为80％.实时定量PCR结果显示,模型组与正常对照组小鼠角膜上皮均未发现IL-4表达.模型组小鼠角膜上皮、结膜组织和颈部淋巴结组织中TSLP mRNA表达量分别是正常对照组的(1.63±0.20)、(2.71±0.48)和(1.48±0.05)倍,差异均有统计学意义(=4.44、14.16、5.01,均P＜0.05);模型组小鼠结膜和颈部淋巴结中IL-4 mRNA表达量分别是正常对照组的(2.94±0.39)倍和(1.74±0.09)倍,差异均有统计学意义(t=9.92、14.54,均P＜0.05).免疫组织化学法检测显示,正常对照组小鼠角膜上皮和结膜上皮细胞中TSLP蛋白表达强度微弱,模型组小鼠TSLP蛋白表达增强.模型组小鼠结膜下组织中可见IL-4呈强阳性表达,正常对照组小鼠结膜下组织中未发现IL-4表达.结论 TSLP主要表达于变应性结膜炎小鼠的角膜、结膜和颈部淋巴结组织,提示其参与变应性结膜炎角膜和结膜的炎症反应;IL-4主要表达于变应性结膜炎小鼠结膜下组织中,提示其主要参与结膜的炎症反应,TSLP和IL-4共同参与变应性结膜炎的发生和发展过程,这2种炎症因子为变应性结膜炎的临床治疗提供了新的靶点.
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ResolvinE1对高危角膜移植免疫排斥反应的抑制作用
背景 以往防治角膜移植术后排斥反应的药物存在诱发局部或全身不良反应的风险,研究表明resolvinE1(RyE1)能够调节辅助性T细胞1(Th1)型免疫反应,但其对高危角膜移植术后的植片排斥反应有无抑制作用尚不清楚. 目的 观察高危角膜移植动物模型局部应用RvE1对植片免疫排斥反应的抑制作用.方法 以BALB/c小鼠为受体、C57BL/6小鼠为供体行角膜移植术.采用随机数字表法将90只BALB/c小鼠随机分成异体角膜移植组、异体角膜移植+RvE1组和自体角膜移植组,每组各30只.BALB/c小鼠右眼先用缝线法刺激2周以建立高危角膜移植眼模型,然后行穿透角膜移植术.异体角膜移植组和异体角膜移植+RvE1组小鼠右眼行异体角膜移植,自体角膜移植组小鼠将右眼角膜植片旋转180°后缝合于植床上.异体角膜移植组及自体角膜移植组小鼠术后每日用生理盐水10μl结膜下注射1次,异体角膜移植+RvE1组小鼠术后同法注射终质量浓度为0.1 μg/μl的RvE1 10μl,连续7d.术后裂隙灯显微镜下观察小鼠角膜植片反应并对其排斥反应进行评分.术后21 d处死各组小鼠各20只,收集小鼠术眼角膜、眼球和术眼侧颈部淋巴结,采用苏木精-伊红染色法观察各组小鼠角膜植片的组织病理学变化;采用免疫组织化学法检测术眼角膜中CD4及γ干扰素(IFN-γ)的表达;采用流式细胞术检测术眼侧颈部淋巴结淋巴细胞中Th1细胞(CD3+ CD8a-IFN-γ+)比例;采用荧光定量PCR法检测Th1细胞相关因子白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-c)、IFN-γ及T-bet mRNA的相对表达水平.结果 异体角膜移植+RvE1组小鼠角膜植片存活时间为(28.5±1.7)d,明显长于异体角膜移植组的(14.0±1.6)d,差异有统计学意义(t=4.14,P＜0.001),自体角膜移植组小鼠植片在术后50 d存活率为100％.苏木精-伊红染色显示,异体角膜移植+RvE1组和自体角膜移植组小鼠角膜植片水肿及炎性细胞浸润程度均轻于异体角膜移植组.免疫组织化学法检测显示,各组角膜全层均有CD4表达,而IFN-γ主要表达于角膜上皮层,异体角膜移植组小鼠角膜组织中CD4和IFN-γ阳性细胞数均明显多于异体角膜移植+RvE1组和自体角膜移植组.流式细胞术检测显示,异体角膜移植+RvE1组和自体角膜移植组小鼠淋巴细胞中Th1细胞比例分别为(1.07±0.25)％和(0.85±0.12)％,明显低于异体角膜移植组的(1.56±0.20)％,差异均有统计学意义(均P＜0.05).荧光定量PCR检测显示,异体角膜移植组小鼠角膜中IL-2、TNF-α、IFN-γ及T-bet mRNA的相对表达量明显高于异体角膜移植+RvE1组和自体角膜移植组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 RvE1可抑制小鼠高危角膜移植排斥反应,作用机制可能与其下调角膜植片和淋巴细胞中Th1细胞及相关细胞因子的表达有关.
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小鼠角膜新生血管内皮细胞的分离培养及其趋化因子受体的表达
背景 研究角膜新生血管生成的病理机制对角膜新生血管的治疗具有重要意义,但目前的相关研究多采用非角膜新生血管来源的血管内皮细胞,研究结果的可靠性受到一定影响. 目的 探索从碱烧伤诱导实验性小鼠角膜新生血管组织中分离和培养血管内皮细胞的方法,并检测新生血管内皮细胞中趋化因子受体的表达,为角膜新生血管内皮细胞的生物学特性研究奠定基础.方法 7～8周龄SPF级健康雄性BALB/c小鼠10只,采用NaOH碱烧伤法构建小鼠实验性角膜新生血管模型,采用免疫荧光技术检测CD31在角膜新生血管中的表达.在碱烧伤后2周摘取眼球分离角膜组织,眼科手术剪剪碎角膜组织后应用胶原酶D消化获取单个细胞,使用包被CD31抗体的磁珠分选获取血管内皮细胞.采用免疫组织化学染色法检测CD31在细胞中的表达以鉴定培养的细胞,采用逆转录PCR法检测血管内皮细胞中趋化因子受体基因的表达.结果 碱烧伤后7d裂隙灯显微镜下可见小鼠左眼角膜出现新生血管,碱烧伤后2周角膜新生血管的形成达高峰,免疫荧光检测可见角膜组织内特异性CD31染色的血管网.角膜新生血管血管内皮细胞培养后2h贴壁生长,形态呈扁平多边形,体积较大,传代培养后细胞生长速度明显加快.培养的角膜新生血管内皮细胞CD31表达阳性,细胞质中呈棕黄色染色,而角膜基质细胞中CD31表达阴性.逆转录PCR结果显示分离培养的血管内皮细胞中CCR1、CCR2、CCR3和CCR4 mRNA相对表达量高,CXCR3、CCR6、CCR10和CX3CR1 mRNA呈中等强度表达,CCR5、CCR8 mRNA相对表达量较低,而CCR9、CXCR4和CXCR5 mRNA表达未检测到.结论 CD31抗体的磁珠分选法可有效分离纯化小鼠角膜新生血管内皮细胞,并可进行体外培养且培养的细胞可表达趋化因子受体.
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甲状腺相关眼病与Th1/Th2免疫平衡
背景 甲状腺相关眼病(GO)是自身免疫性疾病,目前其发病机制尚不清楚,近年来的研究发现Th1/Th2型免疫平衡反应的失调是导致GO的主要原因. 目的 采用脂质体包裹的人促甲状腺激素受体(hTSHR)胞外段基因重组质粒免疫同系雌性BALB/c小鼠以建立GO动物模型,研究关于在GO小鼠模型血清Th 1/Th2型免疫反应平衡状态,探讨GO的病理机制.方法 采用计算机数字随机分配法将同系6～8周龄雌性BALB/c小鼠32只分为重组质粒注射组、空白对照组、空质粒注射组和脂质体注射组.重组质粒注射组分别于实验的0、3、6周采用脂质体包裹的重组质粒pcDNA3.1 +/hTSHR289各30 μg行双胫前肌内注射,再于腹腔内注射40 μg以免疫小鼠,空质粒注射组和脂质体注射组分别采用pcDNA3.1+和脂质体以同样的方法进行免疫,空白对照组不做任何处理.分别于注射前及各次注射后第4天及第17周末处死小鼠行心脏采血,采用ELISA法检查各组小鼠血清中白细胞介素(IL)-2及IL-4质量浓度,计算IL-2/IL-4值.于初次免疫后17周末处死重组质粒注射组小鼠,取甲状腺及眼眶组织制作病理切片,采用苏木精-伊红染色法检测标本组织中炎性细胞浸润情况,对有炎性细胞浸润的标本进行免疫组织化学检测,计算B细胞特异标志物CD20阳性细胞(B)与T细胞特异标志物CD3ε阳性细胞(T)的比值,B∶T＞1.0者为Th2反应,相反者为Th1反应.结果 在第2次和第3次注射后,重组质粒注射组小鼠血清中IL-2质量浓度明显低于空白对照组、脂质体注射组、空质粒注射组,差异均有统计学意义(均P＜0.05),但组间小鼠血清IL-4质量浓度差异无统计学意义(P＞0.05);重组质粒注射组小鼠在第2次、第3次免疫后血清IL-2质量浓度明显低于免疫前及第1次免疫后,差异均有统计学意义(注射前:P=0.009、0.019;第1次注射后:P=0.002、0.004),而处死时小鼠血清IL-2质量浓度有所回升,明显高于第3次免疫后IL-2质量浓度[(44.31±1.77) pg/ml与(42.43±2.29) pg/ml],差异有统计学意义(P=0.031).空白对照组、空质粒注射组、脂质体注射组、重组质粒注射组第2次、第3次注射后血清IL-4质量浓度及IL4/IL2值均明显高于注射前和第1次注射后,其处死时重组质粒注射组小鼠血清IL-4质量浓度明显高于第3次注射后,差异均有统计学意义(均P＜0.05).处死时重组质粒注射组苏木精-伊红染色有炎性细胞浸润的7只小鼠12个眼眶标本中4个眼眶B∶T值＞1.0. 结论 采用脂质体包裹的TSH受体胞外段基因重组质粒免疫同系雌性BALB/c小鼠可成功建立GO动物模型,重组质粒注射组小鼠在初次免疫后17周内以Th1型反应为主,小鼠第2次免疫后免疫平衡开始向Th2型转变.
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BALB/c小鼠角膜细胞密度和大小的活体三维测量
背景 角膜细胞的形态学参数及其密度对角膜结构的完整性及其正常功能的维持具有重要意义.目前,BALB/c小鼠已成为角膜研究中广泛应用的实验动物,了解正常角膜细胞的大小、形态及密度可为相应的实验研究提供参考依据. 目的 应用双光子激光扫描显微镜对BALB/c小鼠的不同角膜细胞进行活体扫描,对细胞密度、细胞大小参数进行活体三维测量,活体观察角膜不同细胞的形态学特征.方法 收集6只8 ～13周龄BALB/c小鼠,麻醉后荧光解剖显微镜下于角膜基质内注射20 μg/ml的胞质膜染料1μl,注射后1.5h于注射部位的对侧注射500 μg/ml Hoechst 33342 1 μl,30 min后使用双光子激光扫描荧光显微镜对角膜中央视野(XY轴)的角膜内皮层、基质层和上皮层进行Z轴逐层扫描,每层扫描厚度为2μm,图像像素为512×512,图像位数为12 bit.应用Imaris软件对扫描的图像进行细胞密度以及细胞大小参数的测量,细胞密度通过计算3维空间内细胞核数目获得;通过软件自动测量角膜上皮基底层、中基质层和内皮层细胞和细胞核的表面积和体积,并计算细胞和细胞核的表面积/体积值和细胞的核质比. 结果 BALB/c小鼠角膜上皮基底层和内皮层均为单层细胞,而中基质层包括2层细胞.小鼠角膜上皮基底层细胞密度为(108.00±18.97) ×104/mm3,明显大于中基质层的(9.27±0.48)×104/mm3和内皮层的(22.30±2.28)×104/mm3,3个组间总体比较差异有统计学意义(F=141.592,P=0.000);以中基质层的细胞表面积和体积大,其次为内皮层,上皮基底层的细胞表面积和体积小,3层细胞间的表面积和体积的总体比较差异均有统计学意义(F=2 222.000、598.504,均P=0.000).小鼠角膜上皮基底层、中基质层和内皮层细胞的表面积/体积值分别为(0.80±0.13)、(0.51±0.07)和(0.40±0.04)/μm,以上皮基底层细胞大,3层间总体比较差异有统计学意义(F=127.075,P=0.000).小鼠角膜以内皮层的细胞核表面积和体积大,其次为中基质层,以上皮基底层细胞的细胞核表面积和体积小,但以上皮基底层细胞核的表面积/体积值大,以内皮层细胞核的表面积/体积值小;小鼠角膜内皮层细胞的核质比明显大于上皮基底层和中基质层细胞. 结论 双光子激光扫描显微镜可对BALB/c小鼠中央角膜3层细胞参数,包括细胞和细胞核表面积及体积进行活体定量测定,为BALB/c小鼠角膜生理、病理和疾病的相关研究提供参考依据.
关键词： 角膜/解剖和组织学 细胞计数 细胞大小 近交系BALB/c小鼠 双光子荧光显微镜 -
眼眶弥漫大B细胞淋巴瘤裸鼠模型的建立
背景 近年来眼眶淋巴瘤的发病率逐渐升高,在病理特点、治疗方法以及发病机制方面的研究不断深入.由于眼眶淋巴瘤发病率低,体外培养困难,眼眶淋巴瘤裸鼠模型研究的报道较少. 目的 应用细胞系pfeiffer建立弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)眼眶裸鼠模型,比较小鼠淋巴瘤模型与人眼眶DLBCL病理标本的病理学特点及生物学行为,探讨全身DLBCL细胞系pfeiffer用于眼眶淋巴瘤研究的可能性.方法 选用SPF级BALB/c裸鼠10只和nod-SCID小鼠5只,先用137 Cs对BALB/c裸鼠(吸收剂量为3.5 Gy)和nod-SCID小鼠(吸收剂量为2.6Gy)进行照射,照射后6h内分别进行小鼠眼眶内(BALB/c小鼠4只眼)及皮下注射(BALB/c小鼠和nod-SCID小鼠各4只眼)pfeiffer细胞,接种细胞密度约为1.5×108/ml,即眼眶接种组和皮下接种组.注射后每日观察肿瘤的生长状态,并绘制肿瘤生长曲线.于注射后54 d无菌条件下完整取出小鼠眼眶肿瘤和皮下肿瘤及附近淋巴结,制备4μm厚组织切片.采用苏木精-伊红染色评估肿瘤的组织病理学特点,采用免疫组织化学法检测模型肿瘤切片中CD20、CD79α、CD45RO蛋白的表达,并根据CD10、BCL-6和mum-1的表达进行分型,依据Ki-67及survivin的表达判断肿瘤的预后,并将模型小鼠的检测结果与人眼眶DLBCL病理标本的特点进行比较.结果 眼眶接种组和皮下接种组成瘤率均为100％,nod-SCID小鼠的肿瘤生长速度快于BALB/c裸鼠.组织病理学检查可见眼眶接种组小鼠邻近淋巴结无肿瘤细胞浸润,皮下接种组小鼠腋窝淋巴结少量肿瘤细胞浸润.苏木精-伊红染色显示,小鼠淋巴瘤组织的组织病理学特点与人眼眶DLBCL标本一致.BALB/c小鼠CD20表达强度＜50％和≥50％的淋巴瘤模型中表达例数分别为3和5,CD79α分别为2和6,CD45RO分别为8和0;nod-SCID小鼠CD20表达强度＜50％和≥50％的淋巴瘤模型中表达例数分别为1和3,CD79α分别0和4,CD45RO分别为4和0;与人眼眶DLBCL标本的1和2,1和2,2和1比较,差异均无统计学意义(均P=1.00);BALB/c和nod-SCID小鼠淋巴瘤模型与人眼眶DLBCL中Ki-67和survivin表达的例数差异均无统计学意义(均P=1.00).BALB/c小鼠、nod-SCID小鼠淋巴瘤模型和人眼眶DLBCL中依据CD10、BCL-6和mum-1的表达均分为非生发中心来源型. 结论 采用pfeiffer细胞系接种法可成功建立眼眶和皮下DLBCL的小鼠模型,这些模型肿瘤在生物学行为、病理学特点和免疫组织化学染色方面均一致.Nod-SCID小鼠较BALB/c小鼠接种后肿瘤生长更快.
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脂质体包裹的促甲状腺激素受体胞外段基因重组质粒免疫法构建小鼠甲状腺相关眼病动物模型的可行性
背景 甲状腺相关眼病(TAO)是眼科临床常见的难治性疾病,发病率在眼眶疾病中居首位.目前对于TAO的研究缺乏可复制的动物模型,在疾病早期阶段难以获得眼眶组织,具体病因及确切的发病机制仍未得到阐明.要详细了解TAO的发病机制,探寻有效防治措施,关键在于建立适当的动物模型. 目的采用脂质体包裹的促甲状腺激素受体(TSHR)胞外段基因重组质粒免疫同系雌性BALB/c小鼠,探讨该方法建立TAO动物模型的可行性. 方法 按照计算机随机分组方法将32只同系6～8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为空白对照组、空质粒注射组、脂质体注射组和重组质粒注射组.分别于0、3、6周免疫各组小鼠,重组质粒注射组小鼠经双胫前肌和腹腔内分别注射阳离子脂质体包裹的pcDNA3.1 +/hTSHR289 30 μg和40 μg;脂质体注射组小鼠分别经双胫前肌和腹腔内分别注射未包裹重组质粒的阳离子脂质体30 μg和40 μg;空质粒注射组小鼠分别经双胫前肌和腹腔内分别注射pcDNA3.1+空质粒30 μg和40 μg;空白对照组小鼠未行任何干预.分别于初次免疫前及初次免疫后1、2、3、4个月测量各组小鼠的体质量,观察小鼠外眼表现.于初次免疫后17周末处死小鼠,取甲状腺及眼眶组织进行组织病理学观察;收集各组小鼠心脏血0.6 ～0.8 ml,采用ELISA法测定小鼠血清总甲状腺素4(TT4)和促甲状腺激素(TSH)的质量浓度. 结果 重组质粒注射组6只小鼠12只眼出现眼球突出、眼睑肿胀和角膜溃疡.空白对照组、脂质体注射组、空质粒注射组小鼠随着时间的延长体质量逐渐增加,而重组质粒注射组小鼠体质量则逐渐下降,总体比较差异有统计学意义(F时间=3.838,P=0.023),不同组间小鼠体质量总体比较差异有统计学意义(F分组=3.425,P=0.028),其中注射后2、3、4个月重组质粒注射组小鼠体质量明显低于空白对照组、空质粒注射组和脂质体注射组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).空白对照组、脂质体注射组、空质粒注射组和重组质粒注射组小鼠血清TT4质量浓度分别为(7.75±1.00)、(7.96±0.76)、(6.76±1.10)和(4.43±2.88) μg/dl,TSH质量浓度分别为(6.36±2.58)、(4.83±3.96)、(6.63±1.71)和(1.60±1.76) ng/ml,总体比较差异均有统计学意义(F=7.150,P＜0.001;F=5.521,P＜0.01),其中重组质粒注射组小鼠血清中TT4和TSH质量浓度均明显低于空白对照组、脂质体注射组、空质粒注射组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).组织病理学检查显示,6只重组质粒注射组小鼠甲状腺出现淋巴细胞浸润,15只眼小鼠眼眶组织出现眼眶内脂肪组织增生、淋巴细胞及肥大细胞浸润、透明质酸沉积以及眼外肌肌纤维肿胀、变性和断裂,并伴有炎性细胞浸润.结论 采用脂质体包裹的TSHR胞外段基因重组质粒免疫同系雌性BALB/c小鼠建立TAO动物模型是一种可行、有效的方法,该模型与人TAO的病理组织学特征相似,成模率高.
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鸵鸟去细胞异种角膜基质载体异位移植对BALB/c小鼠外周血T细胞亚群的影响
背景 鸵鸟去细胞角膜基质具有与人角膜基质相似的天然结构,有望成为直接应用或构建生物角膜理想的载体材料之一. 目的 用鸵鸟角膜制备去细胞基质载体,研究其免疫原性,为产业化开发早日用于临床提供实验基础.方法 收集新鲜鸵鸟和猪眼球各20个,采用低温冷冻联合酶消化及干燥剂脱水法制备鸵鸟及猪去细胞角膜基质载体,用Co60照射法进行消毒.按随机数字表法将雄性BALB/c小鼠45只随机分为伪手术组、猪去细胞角膜基质组和鸵鸟去细胞角膜基质组,伪手术组小鼠仅制作囊袋,不植入异种角膜基质片,其余两组分别取干燥脱水法制备的猪、鸵鸟去细胞角膜基质载体(复水后每片湿质量为10 mg)异位植入BALB/c小鼠背部皮下,术后观察伤口愈合情况,并分别于术后7、14、28 d获取BALB/c小鼠外周血,进行免疫荧光标记及流式细胞仪分析,比较两种异种角膜基质对小鼠CD4+、CD8+、CD25+表型的动态影响.结果 猪、鸵鸟去细胞角膜基质载体小鼠植入处皮肤无红肿及渗出,伤口愈合良好.术后7、14和28 d,伪手术组、猪去细胞角膜基质组和鸵鸟去细胞角膜基质组外周血中CD4+细胞百分率的差异均无统计学意义(F=0.74,P=0.50;F=0.39,P=0.05;F=3.46,P=0.58);外周血中CD8+细胞百分率的差异均无统计学意义(F=1.75,P=0.21;F=1.14,P=0.35;F=0.78,P=0.48);外周血中CD25+细胞百分率差异亦均无统计学意义(F=0.52,P=0.61;F=3.53,P=0.62;F=2.42,P=0.13).结论 鸵鸟去细胞角膜基质载体的免疫原性低,具有重要的开发价值.
