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姜黄素对IL-1β诱导的兔RPE细胞中核因子-κB相关炎性因子表达的抑制作用
背景 白细胞介素-1β(IL-1β)是增生性玻璃体视网膜病变(PVR)早期释放的重要炎性因子,研究证实姜黄素能抑制IL-1β诱导的兔视网膜色素上皮(RPE)细胞的增生,但其是否能够对PVR发挥抗炎作用尚不清楚. 目的 观察姜黄素对IL-1β诱导的兔RPE细胞移行的影响,探讨姜黄素对IL-1β诱导的RPE细胞中炎性因子表达的影响.方法 采用对数生长期原代培养的第4代兔RPE细胞进行实验,在无血清DMEM培养基中分别添加0、0.1、1.0和10.0 μg/L的IL-1β作用于细胞24 h,分别采用Western blot和逆转录PCR法检测细胞中环氧合酶-2(COX-2)蛋白和mRNA的表达以筛选IL-1β佳质量浓度.将培养的RPE细胞分为IL-1β组和姜黄素+IL-1β组,分别在无血清培养基中添加1.0 μg/L IL-1β和1.0μg/L IL-1β联合10 μg/ml姜黄素作用于细胞24、48和72 h,仅用无血清培养基培养的细胞作为对照组.培养的细胞行苏木精-伊红染色,于光学显微镜下计算进入损伤区的细胞数,比较各组细胞的移行能力;分别采用Western blot法和逆转录PCR法检测各组RPE细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量,采用Western blot法检测并比较各组细胞中核因子-κBp65(NF-κBp65)蛋白和核因子κB抑制蛋白-α(IκB-α)的相对表达量;采用免疫化学染色法检测NF-κBp65、IκB-α和COX-2在各组RPE细胞中的表达和定位. 结果 初分离的兔RPE细胞呈球形,细胞中可见大量黑色素颗粒;第4代细胞色素颗粒明显减少,接近融合的细胞形态为长梭形,呈拉网状分布.免疫细胞化学染色法结果显示,细胞角蛋白(AE1/AE3)在细胞质呈阳性表达.对照组在培养24、48和72 h移行的细胞数分别为(31.93±1.21)、(36.27±2.50)和(38.33±2.40)个,IL-1β组分别为(45.73±2.30)、(71.13±1.92)和(80.60±1.71)个,而姜黄素+IL-1β组分别为(13.13±2.20)、(14.93±1.10)和(12.60±1.51)个,各时间点IL-1β组细胞移行细胞数均明显高于对照组,而姜黄素+IL-1β组移行细胞数均明显低于对照组和IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β质量浓度为1.0 μg/L时,RPE细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量达峰,以1.0 μg/L IL-1β的剂量进行后续实验.细胞培养后24、48和72 h,姜黄素+IL-1β组细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量均明显低于IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β作用于细胞后48 h,细胞中NF-κBp65蛋白的相对表达量高,与IL-1β组相比,各时间点姜黄素+IL-1β组细胞中NF-κBp65蛋白相对表达量降低,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β组药物作用于细胞后48 h细胞中IκB-α降至低,各时间点姜黄素+IL-1β组细胞中IκB-α值均明显高于IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).免疫细胞染色结果显示,IL-1β组RPE细胞的细胞核及细胞质中NF-κBp65呈强阳性表达,对照组表达较弱,姜黄素+ IL-1β组细胞中NF-κBp65的表达强度较IL-1β组明显降低;与对照组相比,IL-1β组细胞的细胞质中IκB-α表达强度明显减弱,而COX-2表达明显增强;与IL-1β组比较,姜黄素+IL-1β组细胞中IκB-α表达明显增强,而COX-2表达明显减弱.结论 姜黄素可抑制IL-1β引起的兔RPE细胞的移行,IL-1β通过激活NF-κB信号通路刺激细胞中COX-2的表达,姜黄素可通过阻断这一途径而抑制炎性因子的表达,从而发挥抗炎作用.
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MMPs抑制剂GM6001、MMP-2/9抑制剂Ⅰ及Ⅱ对人晶状体上皮细胞移行的抑制作用
背景 白内障术后残留晶状体上皮细胞(LECs)的增生、移行、上皮-间质转化等生物学行为与晶状体后囊膜混浊(PCO)的发生有关,基质金属蛋白酶(MMPs)参与细胞的移行过程.广谱MMPs抑制剂GM6001能抑制人LECs的移行,但特异性MMPs抑制剂,即MMP-2/9抑制剂Ⅰ和Ⅱ对LECs移行能力的影响及药物的安全性尚不明确. 目的 比较GM6001、MMP-2/9抑制剂Ⅰ和MMP-2/9抑制剂Ⅱ对LECs移行的抑制作用及其对细胞活性的影响.方法 对人LECs系进行培养和传代,取传至3～4代的细胞培养于6孔板中,当细胞生长融合至70％后改用无血清培养液作用12h,在培养液中分别加入不同浓度(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、32.00、64.00、128.00μmol/L)GM6001、MMP-2/9抑制剂Ⅰ和MMP-2/9抑制剂Ⅱ,以基础培养液培养的细胞作为对照组,用200μl无菌枪头在细胞层中划出细胞裸露区,继续培养后24 h计算各组细胞移行的平均距离,计算各种药物对LECs移行的抑制率.在细胞活性的测定中,取传至第2代或第3代LECs,调整细胞密度至5×105/ml,以200 μl/孔接种至96孔板常规培养,分别加入128.00 μmol/LGM6001、64.00μmol/L MMP-2/9抑制剂Ⅰ和32.00 μmol/L MMP-2/9抑制剂Ⅱ,以基础培养液培养的细胞作为对照组,培养24 h后用MTT法测定吸光度(A)值,分析并比较3种药物对LECs活性的影响,评估药物对细胞的毒性作用.结果 正常培养的LECs生长良好,贴壁生长的细胞呈梭形或多边形,排列不规则.随着GM6001、MMP-2/9抑制剂Ⅰ和MMP-2/9抑制剂Ⅱ浓度的增加,LECs移行距离逐渐缩短,总体比较差异有统计学意义(GM6001:F=248.647,P＜0.05;MMP-2/9抑制剂Ⅰ:F=357.125,P＜0.05;MMP-2/9抑制剂Ⅱ:F=396.374,P＜0.05).将对照组细胞移行距离设为1,3种药物浓度为32.00 μmol/L时,GM6001组、MMP-2/9抑制剂Ⅰ组和MMP-2/9抑制剂Ⅱ组细胞的相对移行距离分别为0.478±0.091、0.294±0.088和0.191±0.081,总体比较差异有统计学意义(F=116.031,P＜0.01),其中MMP-2/9抑制剂Ⅱ组中细胞移行距离明显低于GM6001组和MMP-2/9抑制剂Ⅰ组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).对照组、128.00 μmol/L GM6001组、64.00 μmol/L MMP-2/9抑制剂Ⅰ组和32.00 μmol/L MMP-2/9抑制剂Ⅱ组的A值分别为0.607±0.016、0.567±0.015、0.583±0.010和0.595±0.014,总体比较差异无统计学意义(F=1.403,P＞0.05). 结论 3种MMPs抑制剂均可有效抑制体外培养的LECs的移行,且对细胞的生长活性无明显影响,其中MMP-2/9抑制剂Ⅱ的抑制作用强.
关键词： 基质金属蛋白酶/抑制剂 上皮细胞/眼 晶状体/眼 细胞移行/药物作用 后囊膜混浊
