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角膜内皮细胞体外原代培养及生物学鉴定
背景 角膜盲是中国主要的致盲眼病之一.随着组织工程技术的进步和发展,组织工程移植膜的构建将为角膜病的治疗开辟新的途径,而选择和培养理想的种子细胞是工程化角膜的基础. 目的 采用胰蛋白酶消化法体外分离培养角膜内皮细胞(CECs)并进行常规培养,观察并鉴定细胞体外生长的生物学特性,为实验研究和工程化角膜的构建提供种子细胞. 方法 3月龄新西兰白兔12只,摘除新鲜眼球,光学显微镜下将兔角膜带有内皮细胞的后弹力层面完整分离,胰蛋白酶消化、纯化后得到CECs,进行体外培养.倒置显微镜下观察细胞的形态变化;锥虫蓝染色法计算培养细胞的存活率并绘制细胞生长曲线;采用CM-Dil染色法进行细胞标记传代;采用苏木精-伊红染色法观察培养细胞的形态,并用免疫组织化学染色法观察神经元烯醇化酶(NSE)抗体的表达,对细胞进行细胞表型鉴定;扫描电子显微镜下观察培养细胞的表面结构;采用免疫荧光染色法观察细胞质紧密连接蛋白1(ZO-1)的表达.结果 揭取带有内皮细胞的后弹力层联合酶消化法可快速获得大量纯化的CECs,且快速贴壁生长并增生,体外培养5～7 d即融合形成单层,呈铺路石样排列,培养细胞的存活率为95％;CM-Dil染色显示培养的CECs呈现红色环状的荧光颗粒,标记率达90％以上,连续传代后仍显示红色荧光.苏木精-伊红染色显示培养细胞呈多角形,核圆,细胞质中NSE呈棕黄色染色.扫描电子显微镜下可见细胞表面有丰富的微绒毛,细胞间足突相互连接,细胞体积大而扁平;荧光显微镜下可见细胞间ZO-1呈绿色荧光. 结论 通过完整分离角膜后弹力层联合胰蛋白酶消化法可体外培养、纯化和传代兔CECs,传2～3代的细胞具有CECs的生物学特性,有望为组织工程化角膜内皮移植膜的构建提供优质的种子细胞来源.
关键词： 角膜内皮细胞 后弹力层撕除联合酶消化 细胞培养 细胞标记
