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attB位点文献资料
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attB位点核心区定点突变对ΦC31整合酶效率的影响
目的 考察attB位点核心区碱基突变对ΦC31整合酶在真核细胞中催化目的基因整合效率的影响.方法 选取attB位点核心区中可能对ΦC31整合酶效率产生影响的碱基,设计含有相应位点突变的引物,采用大引物法两轮PCR扩增得到含突变碱基的attB片段,将其连入含报告基因的载体pEGFP-N1中得到pEGFP-N1-attBm.以含野生型attB位点的报告基因载体pEGFP-N1-attB作为对照,将上述载体分别与ΦC31整合酶表达质粒共转染HeLa细胞,经过药物筛选、染色、细胞克隆计数后,计算并比较整合效率.结果 成功完成9个含有突变碱基attB位点及报告基因载体的构建.酶切及测序鉴定结果显示每个质粒含1或2个突变碱基.其中6个质粒为目标碱基突变,3个为PCR过程中随机产生的非预期突变.细胞实验结果表明,3个含有突变attB报告质粒的整合率与野生型attB相比无显著性差异,其余6个突变attB报告质粒的整合率与野生型attB相比显著降低(P<0.05),尤其是其中两个attB位点中含有2个碱基突变的报告质粒,整合率降低极为显著(P<0.001).结论 attB位点核心区碱基保守性较强,其中一些关键位点的突变使得整合酶效率降低.
