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胃癌细胞DNA损伤后通过泛素连接酶干细胞因子调节AT丰富结合域1A基因表达
目的 观察胃癌细胞株中泛素连接酶干细胞因子(SCF)对AT丰富结合域1A基因(ARID1A)表达的调控作用.方法 通过DNA损伤诱导剂处理胃癌细胞株,分别用蛋白质合成抑制剂CHX、蛋白酶体抑制剂MG132和环氧甲酮四肽蛋白酶体抑制剂(epoxomicin)处理细胞,利用NAE酶抑制剂MLN4924干扰泛素化,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测不同方法处理后ARID1A mRNA和蛋白的表达,采用Lipofectamine 2000转染Flag-ARID 1A和显性抑制Cullin,Western blot和免疫共沉淀法检测泛素化的ARID1A以及内源性的S期激酶相关蛋白1(SKP1)和Cullin1蛋白表达.结果 在胃癌细胞系NCI-N87和AGS中,用0.5、1.0、2.0、4.0 μg/ml VP16处理24 h后ARID1A的相对蛋白表达量分别为0.803±0.037、0.717±0.056、0.271±0.072、0.301±0.034和0.741±0.023、0.657±0.048、0.235±0.044、0.278±0.041,提示DNA损伤后出现ARID1A表达下调是一种普遍现象(P＜0.05).DNA损伤诱导剂VP16影响ARID1 A的表达稳定是由其导致的ARID1A降解所致,而蛋白酶体抑制剂可以抑制VP16导致的蛋白降解并观察到泛素化的ARID1A.MLN4924可以有效地阻断VP16诱导的ARID1A降解,而用VP16诱导DNA损伤应答后,只有转染入DN-Cullin1组能够稳定表达ARID1A.293T细胞中转染入Flag-ARID1A后,在沉淀出的Flag-ARID1A复合物中可以检测出内源性SKP1和Cullin1蛋白的表达.结论 SCF连接酶是DNA损伤应答后ARID1A降解所必需的,胃癌细胞DNA损伤后ARID1A会被SCF连接酶迅速识别并降解.
关键词： 胃癌 AT丰富结合域1A 泛素连接酶干细胞因子 泛素化
