首页 > 文献资料
-
微小RNA-145靶向Notch通路抑制人韧带成纤维细胞向成骨细胞分化
目的 探讨微小RNA(miRNA,miR)-145对人韧带成纤维细胞(HLFs)向成骨细胞分化的影响及其可能的作用机制.方法 用含地塞米松、抗坏血酸和β-磷酸甘油培养液诱导HLFs细胞向成骨细胞分化,过表达或抑制细胞中miR-145水平,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测ALP活性,Western blot分析骨代谢相关细胞因子以及Notch通路相关蛋白表达,荧光素酶报告基因方法检测miR-145靶基因.结果 强直性脊柱炎患者骨化韧带组织中miR-145表达水平显著下降(0.21±0.09比0.64±0.13;t=7.543,P=0.000);与正常组比较,诱导液处理可显著抑制miR-145的表达(0.22±0.09比0.73±0.13;t=4.812,P=0.009),提高ALP、成骨细胞特异性转录因子(OSX)、Runt相关基因2(Runx2)水平(157.9±23.8比76.7±19.2,t=-4.599,P=0.010;1.01±0.21比0.32 ±0.10,t=-5.138,P=0.007;0.95±0.32比0.27±0.08,t=-3.571,P=0.023),同时抑制破骨细胞分化因子核因子κB受体活化因子(RANK)及其配体(RANKL)表达(0.30±0.17比0.74±0.13,t=3.561,P=0.024;0.36±0.11比0.85±0.20,t=3.718,P=0.021),miR-145过表达可显著削弱诱导液预处理带来的上述改变,而miR-145敲减可增加诱导液的作用;同时miR-145敲减可显著增加诱导液预处理诱导的Notch1、Hes1蛋白表达上调(1.81±0.19比1.20±0.23,t=-3.542,P =0.024;1.66±0.20比1.13±0.22,t=-3.088,P=0.037),提高Notch通路活性,此种作用可被Notch通路抑制剂DAPT逆转;荧光素酶报告基因结果显示miR-145对Notch通路的作用可能通过直接靶向调控解整合素样金属蛋白酶17(ADAM17)蛋白表达实现.结论 miR-145可通过直接靶向ADAM17调控Notch通路活性,进而抑制HLFs向成骨细胞分化.
-
慢病毒介导基因转染人韧带成纤维细胞表达的研究
目的：：探讨慢病毒介导的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转染人韧带成纤维细胞的转染效率,以及转染GFP后是否对韧带成纤维细胞的生物活性产生影响,为下一步实验提供理论依据。方法：采用组织块贴壁法培养原代人韧带成纤维细胞,取P2代细胞进行慢病毒感染,96 h后荧光显微镜观察转染效率,流式细胞凋亡检测法(FACS)及细胞增殖及毒性检测法(MTT)检测其转染前后的生物学活性变化。结果：成功建立人韧带成纤维细胞培养模型,荧光显微镜 GFP阳性细胞率为95%；FACS检测结果显示未转染组与稳定转染组细胞凋亡率分别为(1.91±0.13)%和(1.96±0.12)%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)；MTT结果显示转染前后细胞生物学活性无显著影响(P>0.05)。结论：慢病毒介导的 GFP 基因能高效稳定转染人韧带成纤维细胞,同时并不影响其生物学活性,能满足后续实验的需要。
