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成骨肉瘤细胞SOSP-9607中miRNA的克隆与验证
背景与目的:microRNA(miRNA)是一类非编码蛋白,并参与转录后调节的单链小分子RNA(约20～25个碱基),对基因表达具有重要调控作用,与肿瘤的发生存在着密切的关系.本研究拟克隆成骨肉瘤细胞系SOSP-9607中miRNA,并对部分功能性基因进行验证.方法:以SOSP-9607细胞作为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200 nt),多聚腺苷酸化和5'连接子连接后,通过RT-PCR进行反转录和扩增,克隆到pCR 4-TOPO载体上得到大约109 bp DNA片段,测序后经过生物信息学分析确定miRNA的表达情况.根据当前miRNA的研究现状,在克隆到的miRNA中选取部分功能性miRNA和新发现miRNA,合成相应探针后与从SOSP-9607细胞、HeLa细胞和成骨肉瘤组织中分离出的小片段RNA进行Northern印迹验证.结果:克隆测序后得到182个克隆体,经生物信息学分析发现有47个miRNA(25种),其中含有23种已知的miRNA和2种Nature杂志上预测的miRNA(miR-165和miR-166).选取的三条实体瘤相关的miRNA(miR-21、miR-20a、miR-17-5p)以及两条预测的miRNA进行Northern印迹验证,miR-21、miR-20a、miR-17-5p在SOSP-9607细胞和成骨肉瘤组织中均表达,预测的miR-165和miR-166在SOSP-9607细胞和成骨肉瘤组织中亦均表达,但miR-166在HeLa细胞中没有表达.结论:克隆了SOSP-9607细胞中的miRNA,并验证了部分功能性miRNA的表达,提示miRNA与肿瘤发生可能有密切的关系.
关键词： 骨肉瘤 SOSP-9607细胞系 microRNA 筛选 克隆 Northern blot -
BLCAP基因cDNA的克隆及siRNA表达载体的构建
目的:克隆BLCAP基因cDNA并构建和鉴定针对于BLCAP基因的siRNA真核表达载体.方法:从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞中提取总RNA,经RT-PCR获得BLCAP基因.将该基因克隆到pGEM-T-Easy载体中,酶切及测序鉴定.将合成的siRNA核酸片段退火形成双链后连接到经BamHI和HindⅢ双酶切后的pSilencer4.1真核表达载体,命名为pSilencer4.1-B1以及pSilencer4.1-B2,并进行酶切及测序鉴定.脂质体法转染SOSP-9607细胞系,G418筛选以及RT-PCR验证构建的真核表达载体对目的基因的干涉情况.结果:经酶切及测序鉴定,所获得的目的片段序列BLCAP基因完全相符.重组质粒中含有与理论值相符的插入片段,其测序结果与设计序列一致.经脂质体法转染后pSilencer4.1-B2可明显抑制SOAP-9607细胞的BLCAP表达.结论:成功克隆了BLCAP基因并cDNA构建和验证了其siRNA真核表达载体.
关键词： BLCAP 克隆 siRNA RT-PCR SOSP-9607细胞系
