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pTre-IFNγ文献资料
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Tet-off系统调控人IFNγ基因在小鼠骨髓基质细胞中的表达
背景与目的:Tet-off系统是一个高效、低毒、具有严密开关功能的基因调控系统,本研究构建质粒pTre-IFNγ,初步探讨Tet-off系统调控人干扰素γ(interferon-gamma,IFNγ)基因在小鼠骨髓基质细胞中的表达.方法:SacⅡ、Xba Ⅰ双酶切载体pTre及目的基因,T4连接酶连接,重组体经双酶切、测序鉴定:脂质体介导pTet-off及pTre-IFNγ共转染小鼠骨髓基质细胞;RT-PCR法检测IFNγmRNA,ELISA法检测分泌到培养液中的IFNγ蛋白,分析共转染后IFNγ的分泌规律、共转染后48 h中不同浓度盐酸四环素对IFNγ蛋白分泌的影响及在共转染后第48 h加入盐酸四环素在不同时间阶段对IFNγ蛋白分泌的影响.结果:双酶切及测序证实质粒pTre-IFNγ构建成功;共转染后48 h RT-PCR检测到IFNγ mRNA表达;ELISA法示IFNγ蛋白分泌持续6天,第3天的分泌高峰为每1×106个细胞(720.09±241.51)Pg;共转染后48 h中蛋白分泌量随四环素浓度增加逐渐减少,10～100 ng/ml四环素存在时蛋白分泌接近零;第48 h时添加盐酸四环素后8 h即能明显抑制IFNγ蛋白表达,延长作用时间,抑制效应加重.结论:Tet-off系统能迅速而高效地下调人IFNγ基因在小鼠骨髓基质细胞中的表达.
