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单链TCR分子的构建与酵母表面展示
目的 构建单链T细胞抗原受体(scTCR),借助酵母展示载体对其进行表达和展示,并确定优化的展示时间点.方法 利用融合PCR(fusion PCR)通过linker将TCR分子两条链的可变区连接在一起,构建成scTCR,并克隆入展示载体pYD1;转化酵母细胞后,通过激光共聚焦显微镜观察scTCR的表达情况,并利用流式细胞仪测定其表达曲线;洗脱酵母细胞表面的蛋白质,通过点杂交检测进一步确定scTCR的表达.结果 scTCR被成功地构建和克隆;转化酵母细胞后,激光共聚焦检测表明其分布在酵母细胞的表面,流式细胞检测表明scTCR在诱导24 h左右在酵母细胞表面的展示比例达到峰值;对酵母表面洗脱蛋白的点杂交检测进一步表明了scTCR的表达和展示.结论 所构建的scTCR能够有效地表达并展示在酵母细胞表面,为下一步构建scTCR酵母展示库并确定佳的表达诱导和筛选时机奠定了良好的基础.
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酵母展示筛选scFv方法的建立
目的:利用酵母展示技术建立筛选scFvs的技术平台,为今后从抗体库中筛选高亲和力抗体奠定基础.方法:改造pYD1载体,将其自身所带的GS Linker 上下游两端突变出酶切位点,构建成pYD-x;分别将IL-1β抗体的重链与轻链可变区片段插入pYD-x中GS Linker的上下游,构建出重组质粒pYSD1.从pYSD1上PCR扩增出scFv片段,并将其插入pYD1的MCS区,构建出重组质粒pYSD2.将pYSD1与pYSD2分别转入酿酒酵母EBY100中诱导表达scFv,并用流式细胞术(FCM)检测抗体展示情况.结果:经诱导后,从流式细胞仪检测结果中可以看出EBY100-pYSD1所展示的scFv与抗原结合力很弱,而EBY100-pYSD2则表现出一定强度的结合.结论:本实验证明了pYD-x载体上存在的额外的GS Linker对于抗体展示的必要性,并且成功建立了利用酵母展示载体pYD1进行scFvs筛选的技术平台.
