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胶原水凝胶与基质胶作为骨组织工程支架材料表面涂层修饰效果的比较研究
目的 对比研究胶原水凝胶和基质胶作为骨组织工程支架表面涂层材料的效果.方法 本实验借助原代成骨细胞,通过对碱性磷酸酶(ALP)活性、组织学染色及成骨特异性mRNA水平的分析,研究胶原水凝胶和基质胶对成骨分化的影响.结果 胶原组与基质胶组细胞活力以及增殖能力均增强,并上调成骨相关基因及蛋白,包括碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)和I型胶原蛋白(COL1A1),尤其是胶原水凝胶涂层对细胞生长和成骨分化的促进作用明显大于基质胶涂层.结论 胶原水凝胶涂层比基质胶涂层更有利于成骨分化,更适合作为细胞支架,推荐其作为骨组织工程支架材料的常用表面涂层材料.
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胶原水凝胶支架用于软骨组织工程的实验研究
目的 探讨Ⅰ型胶原浓度对胶原水凝胶理化性能的影响,以及在体外组织工程模型中不同浓度的Ⅰ型胶原水凝胶对软骨细胞表型和基因表达的影响.方法 制备Ⅰ型胶原浓度为12、8、6 mg/mL的3种胶原水凝胶,记为C12、C8、C6.扫描电镜观察形貌,并通过溶胀性能和抗压性能测试表征其理化性能.取2只新生7日龄新西兰大白兔的关节软骨,酶消化法分离、培养软骨细胞.取第2代软骨细胞与3种胶原水凝胶复合体外培养(C12组、C8组及C6组),ld后采用二乙酸荧光素(fluorescein diacetate,FDA)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色,激光共聚焦显微镜观察细胞活性,体外培养14d后行HE和甲苯胺蓝染色观察组织学形态,实时荧光定量PCR测定软骨细胞相关基因,即Ⅱ型胶原、蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅰ型胶原、X型胶原、Sox9 mRNA表达.结果 随着Ⅰ型胶原浓度从6 mg/mL提高到12 mg/mL,胶原水凝胶的理化性质出现明显变化,扫描电镜下纤维网络变得致密;192h时C6、C8、C12溶胀率依次增大,分别为0.260±0.055、0.358±0.072、0.539±0.033,比较差异均有统计学意义(P＜0.05);压缩模量逐渐增加,分别为(4.86±0.96)、(7.09±2.33)、(11.08±3.18)kPa,比较差异均有统计学意义(P＜0.05).体外培养1d,3组凝胶中软骨细胞经FDA/P1染色后,绝大部分被染成绿色,仅有少数被染成红色.14d后组织学观察示:C12组软骨细胞在组织中聚集明显,并出现明显的甲苯胺蓝异染为紫红色的现象;C8组中也有部分增殖聚集的区域,细胞周围有较明显的甲苯胺蓝异染现象；C6组细胞分布较为均匀,也有较明显的甲苯胺蓝异染现象.实时荧光定量PCR检测显示,3组Ⅱ型胶原mRNA和Aggrecan mRNA表达水平相近;Ⅰ型胶原、Sox9和X型胶原mRNA表达水平C12组高,C6组低,C8组介于二者之间,组间差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 提高Ⅰ型胶原浓度至12 mg/mL后,胶原水凝胶具有更好的理化性质,但软骨细胞纤维化和肥大相关基因表达也有所上调.
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大鼠颅骨成骨细胞的胶原水凝胶三维立体培养
目的 建立大鼠乳鼠颅骨成骨细胞(ROBs)的胶原水凝胶三维立体培养模型.方法 取新生SD大鼠颅骨,通过酶消化法获得成骨细胞.将传代培养的第一代(标记为P1代)ROBs与不同浓度Ⅰ型鼠尾胶原(胶原浓度为1、2、3 mg/mL)、DMEM培养液、NaOH等混合,调节混合液pH并将其置于37℃使胶原凝固成形,建立细胞的三维立体培养.ROBs立体培养3d后,普通显微镜观察细胞形态及密度,培养6d后二乙酸荧光素/碘化丙啶(FDA/PI)染色法鉴定细胞存活率;培养3 d、6 d、9 d后CCK-8检测法测定细胞活性,筛选出三维立体培养佳胶原浓度及佳培养体系.扫描电镜和HE染色观察佳培养体系中ROBs细胞形态以及细胞与胶原复合物的黏附和分布情况.结果 胶原浓度为2 mg/mL培养体系,胶原成形好、硬度高.ROBs三维立体培养3d后,胶原浓度为1 mg/mL、2 mg/mL培养体系中细胞饱满、多呈长梭形.胶原浓度为3 mg/mL的培养体系细胞多呈圆形并固缩.胶原浓度为2 mg/mL培养体系中,细胞存活率高(P＜0.05),细胞活性强于1 mg/mL组和3 mg/mL组(P＜0.05).2 mg/mL培养体系组扫描电镜结果显示细胞与胶原复合物黏附较好且细胞形态正常,HE染色结果显示细胞在胶原中分布均匀且细胞形态正常.结论 胶原浓度为2 mg/mL时,能够成功建立ROBs胶原水凝胶三维立体培养模型,该模型中胶原成形较好,硬度较高,细胞生存良好,分布均匀,能够维持正常形态及活性,适用于后期科学研究.
