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水甘油通道蛋白9短发夹RNA的构建与筛选及其对非酒精性脂肪性肝病细胞模型的作用
目的 构建人水甘油通道蛋白9 (AQP9)短发夹RNA (shRNA),筛选出沉默效果明显的重组质粒,检测AQP9的sh.RNA对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)细胞模型的作用.方法 设计合成针对人AQP9的小干扰RNA,退火形成双链shRNA后插入pGenesil-1质粒中,并将其转染L02肝细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot筛选出沉默效果明显的重组质粒.经油酸诱导L02细胞脂肪变性建立NAFLD细胞模型,通过油红O染色,测定甘油三酯、游离脂肪酸及甘油含量,检测重组质粒对NAFLD细胞模型的作用.数据比较采用方差分析.结果 经RTPCR及Western blot筛选,pshRNA-AQP9a转染组mRNA及蛋白质相对表达率为25.10％±1.19％及25.41％±1.96％,与未处理L02细胞组的39.33％±1.69％及35.08％±1.89％相比,均明显降低(P值均＜ 0.01);将重组质粒pshRNA-AQP9a转染NAFLD细胞模型能够降低其AQP9的mRNA及蛋白质表达量;油红O染色结果显示,油酸/pshRNA-AQP9a转染组细胞内脂质含量明显减少.油酸/pshRNA-AQP9a转染组细胞内甘油三酯、游离脂肪酸及甘油含量分别为(2.738±0.231) mmol/L、(1.182±0.168)mmol/L和(0.730±0.084) mmol/L,油酸组分别为(3.218±0.220) mmol/L、(1.538±0.193)mmol/L及(1.024±0.148) mmol/L,油酸/pshRNA-AQP9a转染组均明显降低(P值均＜0.05).结论 降低AQP9表达量能够减轻NAFLD细胞模型的脂肪变性程度,为进一步研究AQP9对NAFLD的基因治疗奠定基础.
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油酸通过磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶途径调节水通道蛋白3和9的表达
目的 研究油酸在非酒精性脂肪变性肝细胞模型中诱导水通道蛋白3 (AQP3)和AQP9表达改变的相关信号转导机制.方法 采用油酸干预人肝癌HepG2细胞构建非酒精性脂肪变性肝细胞模型,油红O染色及吸光度值测定分析其脂肪变性程度,通过实时定量聚合酶链反应与Western blot检测AQP3和AQP9表达改变情况；以常规培养的细胞为对照组,联合油酸及不同信号通路抑制剂诱导HepG2细胞,实时定量聚合酶链反应和Western blot方法检测AQP3和AQP9在非酒精性脂肪变性肝细胞模型中表达改变的相关信号分子机制.多组间数据比较采用单因素方差分析,两组间数据比较采用独立样本t检验. 结果 随着油酸刺激浓度的升高(0、250、500μmol/L),肝细胞内脂肪变性程度增加,AQP3 mRNA表达逐渐下降,而AQP9 mRNA水平逐渐升高,油酸500μmol/L刺激下二者变化均为明显,分别为0.47±0.18和1.57±0.21,与0 μmol/L组比较,差异均有统计学意义(t值分别为4.5450和3.0306,P值均＜0.05)；蛋白质水平检测结果与之一致.油酸联合磷脂酰肌醇-3激酶抑制剂LY294002处理后,AQP9 mRNA水平升高到4.55±0.62,与对照组的1.00±0.10、油酸单独干预组的2.43±0.53和LY294002单独干预组的1.90±0.16相比,差异均有统计学意义(t值分别为9.7909、4.5018和7.1683,P＜0.01或P＜ 0.05).p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)抑制剂SB203580干预可使被油酸抑制的AQP3 mRNA水平恢复到与对照组相近水平(1.27±0.11),AQP9 mRNA则从油酸明显上调的水平下降到0.38±0.09,与干预前相比,差异均有统计学意义(t值分别为5.7455和6.5727,P值均＜0.01).细胞外信号调节激酶抑制剂PD98059和c-Jun N端激酶抑制SP600125干预对AQP3和AQP9的蛋白和基因水平均无明显作用.油酸诱导后,磷酸化丝/苏氨酸蛋白激酶蛋白相对表达水平从0.21±0.02下降到0.13±0.03,磷酸化p38蛋白相对表达水平从0.58±0.06升高到1.02±0.10,差异均有统计学意义(t值分别为3.8431和12.5289,P＜0.01或P＜0.05).结论 油酸通过激活p38 MAPK信号通路下调AQP3的表达,而通过抑制磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶途径并激活p38MAPK途径刺激AQP9表达升高.
