首页 > 文献资料
-
利用蛋白导入法沉默线粒体分裂调节蛋白Drp1的表达
目的:表达和纯化3转录反式激活因子-RNA结合结构域(3 Trans-Activator of Transcription-RNA binding domain,3TAT-RBD)重组蛋白,并利用蛋白导入法将siRNA运输到细胞中进行基因沉默实验.方法:将双链RNA激活蛋白激酶PKR的RNA结合域(Motif1)与细胞穿膜多肽TAT融合构建3TAT-RBD,并通过原核表达体系进行目的蛋白的表达和纯化.获取重组3TAT-RBD蛋白后,利用非变性胶电泳检测3TAT-RBD与荧光标示Cy3-dsRNA的结合能力.利用蛋白导入法和荧光显微镜观察3TAT-RBD将Cy3-dsRNA导入胶质瘤细胞的效率.在细胞水平检测和比较3TAT-RBD和Lipofectimine 2000将Cy3-dsRNA导入细胞的效率以及对沉默线粒体分裂蛋白动力蛋白相关蛋白1 (dynamin-related protein 1,Drp1)的效果.结果:通过原核表达体系获得3TAT-RBD重组蛋白,体外结合实验证实3TAT-RBD与双链dsRNA具有良好的结合能力.荧光显微镜观察也发现3TAT-RBD与Lipofectimine 2000均能将Cy3-dsRNA导入gli36胶质细胞.在RNA干扰实验中发现,3TAT-RBD和Lipofectimine 2000均能有效地抑制Drp1的表达,Lipo+siRNA和3TAT-RBD+siRNA组Drp1的表达水平分别为对照组的36％和42％.结论:本研究中构建的3TAT-RBD利用了细胞穿膜多肽和RBD与dsRNA结合特性,有效地将siRNA导入细胞进行基因沉默实验,这将为今后RNA干扰实验提供新的工具.
关键词： 穿膜多肽 双链RNA激活蛋白激酶 蛋白运输法 RNA干扰 基因沉默 -
利用9R-GFP-PHD检测细胞膜上PIP2的动态变化
目的：通过原核细胞表达和纯化9R-GFP-PHD重组蛋白，并利用纯化后的9R-GFP-PHD蛋白来检测与磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP2）和 IP3的结合能力以及细胞膜上 PIP2的动态变化。方法通过分子克隆技术将磷脂酶 C-δ1的普列克同源域（PHD）、荧光蛋白 GFP及细胞穿膜多肽9R融合以构建相应蛋白表达载体。利用原核表达体系 BL21大肠埃希菌和镍柱进行重组蛋白的表达和纯化，其中 GFP和9R-GFP为9R-GFP-PHD的对照蛋白。获取重组蛋白后，通过同位素实验和液体闪烁计数器，分别检测和比较 GFP、9R-GFP和9R-GFP-PHD与[3H]标记的 PIP2和 IP3的结合能力以及之间的竞争性抑制。另外，利用MDCK细胞检测和比较孵育的 GFP、9R-GFP和9R-GFP-PHD后，3种重组蛋白在细胞内的分布情况。通过图片相减处理和荧光实时定量分析 MDCK细胞膜上的9R-GFP-PHD在 ATP刺激后分布的动态变化，从而间接反映细胞膜上 PIP2的水解变化。结果通过原核表达和镍柱纯化体系顺利获得了GFP、9R-GFP和9R-GFP-PHD重组蛋白。体外结合实验证实9R-GFP-PHD与PIP2和IP3均有很强的结合能力，而且IP3能竞争性抑制9R-GFP-PHD与PIP2的结合。在孵育了3种荧光融合蛋白后，荧光共聚焦显微镜观察发现9R-GFP 主要分布在细胞质中，而9R-GFP-PHD特异性分布于细胞膜上。荧光实时定量分析显示，ATP刺激通过P2y受体激活磷脂酶C以水解 PIP2，从而使 MDCK细胞膜上的9R-GFP-PHD减少20％左右。结论本研究中构建的9R-GFP-PHD利用了细胞穿膜多肽、PHD与 PIP2和 IP3结合特性及 GFP 的荧光可视和定量分析特性，有效地检测细胞膜上PIP2的动态变化，将为今后进一步研究细胞内钙动员提供新的工具蛋白。
