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上调核糖核酸酶抑制因子对小鼠黑色素瘤B16细胞生长和凋亡的影响
目的 研究核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因表达对小鼠黑色素瘤B16细胞生长和凋亡的影响.方法 构建RI真核表达质粒plRES2-EGFP-RI稳定转染B16细胞,未转染和空质粒作对照组(pIRES2-EGFP组),经G418筛选出阳性克隆.RT-PCR、免疫印迹和免疫荧光检测RI的表达;MTF检测细胞的增殖;流式细胞术、TUNEL及Hochest33342检测细胞周期及凋亡;Western blot检测凋亡相关的蛋白及ILK/PI3 K/AKT信号通路关键分子的表达;分别注射各组B16细胞到C57/BL小鼠建立移植瘤模型,观察肿瘤的生长及肿瘤微血管的变化,进一步分析ILK/PI3 K/AKT信号通路蛋白在肿瘤组织中的表达.结果 转染RI细胞组的RI mRNA和蛋白表达水平显著升高;MTT结果显示B16-RI细胞较对照组增殖能力明显降低,流式细胞结果显示B16-RI细胞的S期明显增加,表明RI表达上调后细胞生长停滞于S期(P＜0.05);Hochest 33342、TUNEL及Annexin V和PI双染色流式法细胞凋亡检测结果证实,B16-RI细胞与对照组相比出现大量凋亡细胞(P＜0.01)及典型凋亡形态特征:染色质凝集,核碎裂和明亮的蓝色荧光等;Western blot结果显示,与对照组相比,B16-RI细胞中ILK、p-Akt、p-GSK3β、Bcl-2及β-catenin的表达明显降低,而活化的Caspase-3和Bax蛋白的表达显著增加(P＜0.01);动物的移植瘤实验结果显示,转RI组的小鼠的瘤重显著降低(P＜0.01),瘤组织中的血管密度明显减少,同时ILK、p-Akt、p-GSK3p、β-catenin在瘤组织中表达减少.TUNEL肿瘤组织凋亡检测结果与体外细胞一致.结论 过表达RI可能通过调节ILK/PI3 K/AKT信号通路显著抑制了小鼠黑色素瘤B16细胞的生长并诱导了B16细胞的凋亡.
关键词： 核糖核酸酶抑制因子 B16细胞 增殖 凋亡 ILK/PI3K/AKT信号通路
