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SARS冠状病毒S蛋白在HeLa细胞中的表达
目的探索非病毒载体转染的SARS冠状病毒S蛋白真核细胞内的定位和能否组装到细胞膜,及其在感染中可能发挥的作用.方法构建能够表达融合绿色荧光蛋白的SARS-COV S蛋白的质粒,通过非病毒载体转染HeLa细胞,激光共聚焦荧光扫描显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位;利用SARS患者康复血清进行蛋白印迹杂交,确定SARS-COV S蛋白在真核细胞中的存在形式.结果在镜下发现通过非病毒载体转染的S融合蛋白荧光弥散于被转染的整个细胞内,尤以细胞核区更为密集,而没有集中定位于细胞膜上.这种定位分布不随蛋白表达时间延长而发生显著变化;蛋白印迹杂交显示在80～90KD的区域有特异性条带.结论非病毒载体转染的SARS冠状病毒S蛋白分布于真核细胞核及胞浆内,而不能组装到细胞膜上;其在HeLa细胞中不是以完整形式存在,有被蛋白酶切割的可能性.
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内毒素与内皮细胞直接结合和损伤特性的研究
目的观察内毒素(LPS)和内皮细胞的结合及损伤特性.方法分离培养大鼠心肌微血管内皮细胞(MMECs),选择不同浓度的LPS及同一浓度不同时相点,作用于贴壁状态的MMECs,应用流式细胞仪、激光共聚焦荧光扫描显微镜(laser confocal scanning microscope, LCSM )进行观察和图象分析.结果 (1)随孵育时间延长,LPS作用后MMECs的OD值逐渐增加,30 min为高点,有时间依赖性.(2)LPS和MMECs共培养2 h,LPS浓度从0.031 25～2.000 00g/L,都可以使MMECs的阳性细胞数及OD值增加,0.2500g/L时是OD值的峰值,提示该浓度是LPS与MMECs的佳结合浓度,有浓度的饱和性.(3)LPS可以进入MMECs胞浆和胞核.(4)LPS可导致MMECs的核移位和脱核.结论 (1)LPS在无血清状况下可以与内皮细胞结合,并进入细胞核.(2)LPS可导致内皮细胞的直接损伤.
关键词： 激光共聚焦荧光扫描显微镜 内毒素 心肌微血管内皮细胞
