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BMP-12重组腺病毒载体转染外周血MSCs向肌腱/韧带细胞分化研究
目的 探讨携带BMP-12基因的腺病毒载体转染诱导外周血MSCs向肌腱/韧带细胞分化的效果.方法 取3～4月龄新西兰兔外周血,体外分离培养外周血MSCs至第3代.采用AdEasy腺病毒载体系统制备BMP-12重组腺病毒载体.将BMP-12重组腺病毒体体外转染第3.代外周血MSCs,转染后24 h通过流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测转染效率,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,转染后8、24 h在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达;转染后0、7、14 d,采用免疫组织化学染色观察Ⅰ型胶原表达情况;实时定量PCR检测肌腱/韧带特异基因Tenomodulin、Tenascin-C和Decorin mRNA表达水平,并设未转染细胞作为对照组.结果 转染后24 h,倒置相差显微镜观察示细胞生长增殖缓慢,细胞形态清晰;FCM检测示,转染组转染效率为99.57％,未转染组为2.46％;转染后8h,荧光显微镜下即可见GFP表达,随培养时间延长GFP表达逐渐增多,24 h时几乎所有细胞均可见GFP表达.免疫组织化学染色示,随转染时间延长,Ⅰ型胶原表达逐渐增强;转染组转染后14 d,肌腱/韧带特异基因Tenomodulin、Tenascin-C和Decorin mRNA表达水平分别为0.061±0.013、0.029±0.008、0.679±0.067,均显著高于未转染组的0.004±0.002、0.003±0.001、0.142±0.024,差异有统计学意义(t=-7.700,P=0.031;t=-5.741,P=0.020;f=-12.998,P=0.000).结论 BMP-12重组腺病毒载体可明显促进外周血MSCs向肌腱/韧带成纤维细胞表型分化,并促进肌腱/韧带特异基因表达和细胞外基质产生,为外周血MSCs用于肌腱/韧带再生提供了依据.
