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慢病毒介导小干扰RNA干扰促分裂原和应激激活的蛋白激酶1对大鼠脊髓损伤的修复作用
目的 探讨促分裂原和应激激活的蛋白激酶1 (mitogen-and stress-activated protein kinase 1,MSK1)在大鼠脊髓损伤后的表达变化及对脊髓损伤的修复作用.方法 雄性SD大鼠120只(体质量220～250 g),取其中70只随机分为假手术组和脊髓损伤组(n=35),脊髓损伤组按照Allen法制作大鼠脊髓损伤模型,假手术组仅打开椎板不损伤脊髓;造模后8、12h及1、2、3、5、7d取材(n=5)行Western blot检测MSK1及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白表达变化.另取20只SD大鼠同上法分组(n=10),于脊髓T10水平背侧深约0.8 mm处注射阴性对照慢病毒LV3NC稀释液,倒置荧光显微镜下观察1、3、5、7、14 d的转染效果,确定病毒佳转染时间.将剩余30只SD大鼠随机分为单纯脊髓损伤组(A组)、脊髓损伤后转染阴性对照慢病毒LV3NC组(B组)和脊髓损伤后转染MSK1小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)组(C组),每组10只.于术后1、3、5、7、14d行大鼠后肢功能BBB评分;于病毒佳转染时间点取材行Western blot检测脊髓组织中MSK1及PCNA蛋白表达变化,并采用免疫荧光染色检测MSK1及PCNA在脊髓中的定位表达.结果 Western blot检测示假手术组各时间点脊髓组织中的MSK1及PCNA蛋白表达无明显变化.脊髓损伤组MSK1蛋白表达于伤后8h开始逐渐下降,至伤后3d降至低,而后逐渐上升;PCNA蛋白表达与MSK1表达趋势相反.脊髓损伤组伤后1、2、3、5 d MSK1蛋白表达量显著低于假手术组,伤后8h及1、2、3、5、7 d PCNA蛋白表达量显著高于假手术组,差异均有统计学意义(P＜0.05).脊髓损伤组及假手术组大鼠脊髓组织在慢病毒转染后各时间点均有较强的荧光表达,转染7d内荧光强度与时间成正相关,7d时达高峰.随术后时间延长,A、B、C组BBB评分均呈逐渐上升趋势,术后5、7、14dC组BBB评分显著低于A、B组(P＜0.05).慢病毒转染7d后,Western blot检测示C组MSK1蛋白表达量显著低于A、B组,PCNA蛋白表达量显著高于A、B组,差异均有统计学意义(P＜0.05).免疫荧光染色显示MSK1在脊髓表达并存在于细胞核中,并与绿色荧光蛋白、神经元核抗原及神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)共定位.免疫荧光染色示,C组MSK1阳性细胞相对表达面积显著高于B组,PCNA、GFAP阳性细胞相对表达面积显著低于B组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 慢病毒介导MSK1siRNA转染大鼠脊髓组织,能够有效沉默MSK1的表达,MSK1可能通过调控神经胶质细胞的增殖,在大鼠脊髓损伤修复中发挥一定作用.
