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钙结合蛋白S100A4基因静默对氧诱导视网膜新生血管的抑制作用及其机制
目的 观察探讨钙结合蛋白S100A4基因静默对氧诱导视网膜新生血管(RNV)的抑制作用及其机制.方法 7日龄C57BL/6J小鼠150只随机分为正常组、正常-病毒对照组、单纯模型组、基因治疗组、空白载体组,每组30只.正常组、正常-病毒对照组小鼠在常氧环境下饲养;其余3组小鼠建立氧诱导视网膜病变模型.小鼠12日龄时,基因治疗组及空白载体组小鼠双眼玻璃体腔注射病毒滴度为1.0×109 PFU/ml的携带针对S100A4小干扰RNA的重组腺病毒载体(Ad-S100 A4-RNAi)和带绿色荧光蛋白的空白腺病毒载体各1.0μl;正常-病毒对照组小鼠玻璃体腔注射同样滴度的等量Ad-S100A4-RNAi.正常组及单纯模型组小鼠不做任何处理.小鼠15日龄时,基因治疗组和正常组作视网膜组织冰冻切片观察病毒转染情况.小鼠17日龄时,各组作视网膜组织切片,计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核;作全视网膜铺片免疫荧光染色,观察视网膜血管变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)及实时PCR检测小鼠视网膜S100A4、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(bcl-2)、半胱天冬酶(Caspase)-3及环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)的蛋白和mRNA表达.结果 荧光显微镜观察发现,正常组小鼠视网膜未见病毒绿色荧光,仅可见少量自身荧光;基因治疗组小鼠视网膜神经节细胞层、内丛状层、内核层、外丛状层可见病毒绿色强荧光,外核层可见少量弱荧光.单纯模型组突破内界膜的血管内皮细胞核计数较正常组明显增加,差异有统计学意义(t=15.68,P＜0.05);基因治疗组突破内界膜的血管内皮细胞核计数较单纯模型组、空白载体组明显下降,差异均有统计学意义(t=13.61、14.64,P＜0.05).与单纯模型组、空白载体组比较,基因治疗组小鼠RNV面积、无灌注区面积明显减少,差异均有统计学意义(P＜0.05).Western blot及实时PCR检测结果显示,与单纯模型组、空白载体组比较,基因治疗组小鼠视网膜S100A4、bcl-2、CREB蛋白及mRNA表达明显下调,差异均有统计学意义(P＜0.05);Caspase-3蛋白及mRNA表达明显上调,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 S100A4基因静默可抑制氧诱导RNV.其机制可能与S100A4基因静默下调bcl-2、CREB表达,上调Caspase-3表达作用有关.
