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以慢病毒为载体的整合素β8RNAi在新生鼠脑内干扰效率的研究
目的 制备稳定表达pSicoR-β8 shRNA的慢病毒载体系统,并评估其在新生鼠脑内RNA干扰(RNAi)效率.方法 将慢病毒表达载体pSicoR-β8 shRNA、pSicoR-对照序列与慢病毒包装质粒系统pDM2G、g/pRRE和pRSV Rev分别进行扩增及质粒酶切鉴定,然后共转染293T包装细胞株,通过293T细胞的包装和分泌以收集携带目的干扰片段的慢病毒颗粒.利用PEG-it病毒浓缩试剂进行浓缩,50％组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度.将浓缩后的慢病毒颗粒通过侧脑室注射对新生SD乳鼠中枢神经系统野生表达的整合素β8进行干扰,荧光显微镜下观察慢病毒侧脑室注射后脑组织中绿色荧光蛋白(GFP)的表达,结合RT-PCR和Western blot方法检测β8mRNA和蛋白在干预后表达水平的变化,以评估RNAi效率及选择佳干预时间.结果 质粒扩增及酶切结果显示各质粒片段大小分别与质粒图谱大小一致,浓缩后测得的病毒滴度为LV-对照序列:1.0×108 PFU/mL,LV-β8 shRNA:5.0×108 PFU/mL.慢病毒侧脑室注射后1d,侧脑室周围即可观察到携带GFP的慢病毒整合到宿主细胞基因组并发出绿色荧光,注射后2d、3d和5d可在脑组织切片中观察到较强的绿色荧光.β8 mRNA表达水平在RNAi后1～3 d出现降低(P＜0.05),第3天达到大抑制作用,其β8mRNA抑制率约为56％.β8蛋白表达变化趋势与β8 mRNA表达变化趋势基本一致,RNAi后第3天达到大抑制作用,其β8蛋白抑制率约为51％.结论 成功获得滴度达到体内实验要求的含有β8 shRNA的慢病毒颗粒,并具有较好的体内干扰活性,为进一步研究整合素β8在新生鼠脑组织中的生理功能奠定了基础.
