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反向亲和层析文献资料
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妊娠相关蛋白A的纯化及鉴定研究
目的:对比G200凝胶过滤、反向亲和层析、DEAE离子交换等不同的方法纯化孕妇血清中的妊娠相关蛋白A(PAPP-A),为下一步的临床应用研究奠定基础.方法:把正常男性血清过G200凝胶过滤纯化后免疫家兔得到兔抗人抗体,连接溴化氰活化G25凝胶制备反向免疫层析柱.收集足月孕妇血清,离心后依次应用G200凝胶过滤、反向亲和层析及离子交换层析柱纯化.用ELISA检测试剂盒检测各个洗脱峰的PAPP-A活性,SDS-PAGE检测纯化蛋白的纯度.结果:稀释兔抗人血清抗体至浓度为1∶16,双向扩散有明显沉淀线,可以用于制备抗体,蛋白A亲和层析洗脱pH3.0洗脱峰,G200凝胶过滤第一个洗脱峰,反向亲和层析的0.1 mol/LPBS洗脱峰,离子交换层析的0.45mol/L NaC1洗脱峰中PAPP-A活性均较高.SDS-PAGE结果显示,孕妇血清用G200凝胶过滤处理后杂蛋白条带较多,反向亲和层析或者DEAE分别处理后同样存在杂蛋白条带,三种纯化方法结合应用杂蛋白条带明显减少,Western blot鉴定显示三种方法结合应用后纯化蛋白样品条带单一.结论:本研究用三种层析方式相结合的方法得到纯度较高的PAPP-A抗原,鉴定显示可以到达制备单克隆抗体(mAb)的要求,为mAb的制备以及酶联免疫试剂盒的建立奠定了基础,使PAPP-A在临床应用方面前景广阔.
